重組右旋糖酐蔗糖酶固定化方法的研究.pdf

1、右旋糖酐在醫(yī)藥、化工和食品工業(yè)中都有重要的應用。目前工業(yè)上主要以腸膜樣明串珠菌直接發(fā)酵法生產(chǎn)右旋糖酐，此方法水解過程引入難以去除的氯離子，降低了產(chǎn)品質(zhì)量并對環(huán)境造成污染。本實驗在已經(jīng)完成重組大腸桿菌高效表達右旋糖酐蔗糖酶研究的基礎上，利用酶工程的方法將重組右旋糖酐蔗糖酶進行固定化研究，并對右旋糖酐合成及其分子量控制進行初步探索。
　　 本研究首先分別以Eudragit L-100及羥基磷灰石生物陶瓷吸附、海藻酸鈉包埋、戊二醛交聯(lián)

2、和Ni-NTA親和吸附等方法對重組右旋糖酐蔗糖酶的固定化進行了初步研究，相較于其他方法最終選擇海藻酸鈉包埋作為該酶的固定化方法進行研究，因為該法所得的固定化酶活力較穩(wěn)定，活力回收率可達45％，能重復利用，且成本較低適宜工業(yè)化生產(chǎn)。
　　 然后對原有的海藻酸鈉包埋該酶的固定化方法進行優(yōu)化，選擇海藻酸鈉/瓊脂混合法固定化重組右旋糖酐蔗糖酶。經(jīng)過優(yōu)化的固定化工藝參數(shù)如下：海藻酸鈉與瓊脂的體積比為1∶1，酶液與包埋材料的體積比為1∶3，

3、固定化形狀為薄膜狀，緩沖體系搭配為制酶用加0.05g/L CaCl2的0.02mol/L HAc-NaAc緩沖液、底物用0.05 g/L Ca(Ac)2的0.02mol/L HAc-NaAc緩沖液，氯化鈣濃度為1.5％，固定化溫度為0℃，固定化時間為15min。以蔗糖為底物，該固定化酶的最適反應溫度為40℃，最適pH為5.4，最適底物濃度為5％，動力學常數(shù)Km值為28.35mmol/L。結(jié)果表明重組右旋糖酐蔗糖酶經(jīng)海藻酸鈉和瓊脂固定化后

4、穩(wěn)定性提高，與游離酶相比可以較長時間保持很高的活力，固定化酶可以反復使用6次以上，酶活回收率可達40％以上，且最適反應溫度較游離酶提高了10℃。
　　 在海藻酸鈉/瓊脂混合法固定化重組右旋糖酐蔗糖酶的基礎上引入吸附劑羥基磷灰石繼續(xù)改良上述固定化方法，利用吸附-包埋協(xié)同固定化右旋糖酐蔗糖酶。優(yōu)化后的工藝參數(shù)為：吸附溫度10℃，羥基磷灰石用量0.05g/ml，吸附時間10h，其他參數(shù)不變。以蔗糖為底物，該固定化酶的最適反應溫度為30

5、2，最適pH為4.2，最適底物濃度為5％，動力學常數(shù)Km值為30.56mmol/L。結(jié)果表明包埋前先以羥基磷灰石吸附較之前單純使用海藻酸鈉和瓊脂包埋使固定化酶活力提高了15倍，且固定化酶的pH穩(wěn)定性也有明顯提高。
　　 最后，利用固定化酶合成右旋糖酐并對其分子量進行調(diào)控進行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)右旋糖酐酶的引入能夠有效控制產(chǎn)物的分子量。通過控制右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶的比例、反應時間、蔗糖濃度、反應溫度和pH可以一步合成所需分子