產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的代謝工程研究.pdf

1、本研究以通過逆向代謝工程方法重構(gòu)的枯草芽孢桿菌BS110為出發(fā)菌株，應(yīng)用理性代謝工程方法從增強(qiáng)核黃素生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)，增加前體物GTP的供給，改進(jìn)能量代謝等幾個方面構(gòu)建高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌，最后工程菌核黃素產(chǎn)量達(dá)到4.2 g/L，得率達(dá)到40 mg/g葡萄糖。
　　首先對枯草芽孢桿菌BS110工程菌的嘌呤途徑進(jìn)行代謝工程改造，增加前體物GTP的供給。敲除guaC基因，阻斷GMP合成IMP途徑；進(jìn)一步過表達(dá)prs和yw

2、lF基因，提高PRPP和核糖-5-磷酸的濃度，增加進(jìn)入嘌呤途徑的代謝通量；最后過表達(dá)guaB基因，增強(qiáng)IMP合成GMP的代謝通量，構(gòu)建工程菌BS118；搖瓶發(fā)酵，菌株BS118核黃素產(chǎn)量達(dá)到1194.95±45.58mg/L，得率達(dá)到11.61±0.47 mg/g葡萄糖。與出發(fā)菌株BS110相比，核黃素的產(chǎn)量和得率分別提高44.6％和37.2%。
　　以嘌呤途徑代謝工程修飾的BS118菌株為基礎(chǔ)，對其呼吸鏈進(jìn)行代謝工程改造，以提高

3、工程菌的能量利用效率。敲除能量利用效率偏低的編碼bd氧化酶的cyd基因，構(gòu)建工程菌BS119；搖瓶發(fā)酵，菌株BS119核黃素產(chǎn)量達(dá)到1296±34.03mg/L，核黃素的得率達(dá)到11.72±0.05mg/g葡萄糖。提高菌體的能量利用效率后并沒有顯著提高核黃素的產(chǎn)量，很有可能是因為，對于工程菌BS119來說，核黃素生物合成基因的表達(dá)量是限制核黃素合成能力的因素。
　　進(jìn)一步通過增加核黃素操縱子的劑量和阻斷孢子形成途徑，以提高核黃素的

4、生物合成能力。在工程菌BS119基因組淀粉水解酶基因位點整合一個核黃素操縱子，構(gòu)建工程菌BS120，工程菌BS120核黃素?fù)u瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到1854±31.87 mg/L；在BS120基礎(chǔ)上敲除sigE基因，阻斷孢子的形成，核黃素得率提高13%；同時在BS120基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)入pMX45游離型質(zhì)粒以及在基因組上進(jìn)行核黃素操縱子的串聯(lián)擴(kuò)增，構(gòu)建工程菌BS125。工程菌BS125核黃素產(chǎn)量達(dá)到4.2 g/L，得率達(dá)到40 mg/g葡萄糖。工程菌B