羊口瘡病毒重慶株的分離鑒定及其F1L基因原核表達(dá)研究.pdf

1、羊口瘡病毒（Orf virus，OrfV）屬于痘病毒科、副痘病毒屬成員，為有囊膜線性雙股DNA病毒，是引起綿羊、山羊發(fā)生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮膚、黏膜形成丘疹、膿皰、潰瘍以及結(jié)成疣狀厚痂為主要特征的接觸性、嗜上皮性、人獸共患傳染病病原。國(guó)內(nèi)外的研究已證明該病毒是一種變異性較強(qiáng)的病毒，各地分離的病毒在致病性上存在著較大差異，基因組限制性酶切圖譜分析表明也存在差異。2013年10月重慶市江津縣某羊場(chǎng)羊只出現(xiàn)疑似羊口瘡疫情。為了獲得地方

2、流行毒株，分析主要抗原基因F1L基因的分子變異特點(diǎn)以及為羊口瘡防控的研究奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展了以下研究：
　　1.羊口瘡病毒重慶株（OrfV-CQ株）的分離鑒定：采集病羊口唇部痂皮，提取核酸，PCR鑒定為羊口瘡病毒陽(yáng)性，以陽(yáng)性病料接種MDBK細(xì)胞分離病毒，通過(guò)透射電鏡、間接免疫熒光、PCR方法擴(kuò)增、序列測(cè)定及同源性分析和動(dòng)物感染試驗(yàn)鑒定病毒。結(jié)果：陽(yáng)性病料接種MDBK細(xì)胞后，F(xiàn)1至F3代并無(wú)明顯CPE現(xiàn)象，F(xiàn)4代MDBK細(xì)胞于48

3、 h開(kāi)始變圓、聚集、融合、拉網(wǎng)甚至脫落；透射電鏡觀察感染細(xì)胞的胞漿中有大量成熟與未成熟的病毒粒子；在接毒MDBK細(xì)胞漿中觀察到了亮綠色的免疫熒光；提取F3~F13代接毒細(xì)胞懸液DNA，PCR方法均能擴(kuò)增出特異性目的片段（708 bp），該序列與GenBank中38株OrfV-F1L基因核苷酸的同源性為97％~99%；測(cè)定F6代細(xì)胞毒TCID50值為10-4.25/0.1 mL；細(xì)胞培養(yǎng)物人工接種宿主動(dòng)物山羊，能復(fù)制出與羊口瘡相似的臨床癥

4、狀。
　　2.羊口瘡病毒重慶株（ OrfV-CQ株） F1L基因的生物信息學(xué)分析：根據(jù)GenBank上收錄OrfV基因序列(No.AY040083)，應(yīng)用Premier Primer5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)OrfV-F1L基因全長(zhǎng)引物，對(duì)OrfV-CQ株F1L基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定。應(yīng)用生物信息學(xué)相關(guān)軟件（DNAStar，SignalP4.1等）分析序列同源性，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位和信號(hào)肽。結(jié)果顯示：

5、F1L基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1023 bp，編碼340個(gè)氨基酸；與Genbank收錄20株相應(yīng)序列核苷酸同源性為93.9%~98.4%，氨基酸的同源性僅與shanxi株（登錄號(hào)HQ221964）同源，為95.0%，與其余序列氨基酸同源性為12.2%~13.1%；二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和β折疊較少，β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲較多，預(yù)測(cè)此蛋白可能存在13個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，無(wú)信號(hào)肽區(qū)域。
　　3.羊口瘡病毒重慶株（ OrfV-CQ株） F1L基

6、因的原核表達(dá)研究：提取OrfV-CQ株病毒核酸為模板，擴(kuò)增F1L基因，并將其克隆至pET-32a載體中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-F1L，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21，優(yōu)化表達(dá)條件，SDS-PAGE及Western bloting檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況及其反應(yīng)原性。結(jié)果：PCR擴(kuò)增出F1L基因全長(zhǎng)1023 bp，pET32-F1L在BL21工程菌中最佳表達(dá)時(shí)間為5 h， IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L，融合蛋白大小為57.4 k