miR-130b通過(guò)抑制CYLD表達(dá)維持NF-κB信號(hào)通路持續(xù)活化促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在揭示miR-130b在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的角色，并且通過(guò)研究miR-130b在NF-κB信號(hào)通過(guò)活化中的作用，來(lái)進(jìn)一步闡明膀胱癌中NF-κB信號(hào)持續(xù)活化的機(jī)制，進(jìn)一步明確膀胱癌發(fā)展的分子基礎(chǔ)。同時(shí)，miR-130b作為NF-κB信號(hào)持續(xù)活化的中間調(diào)節(jié)因子，有潛力可能成為一個(gè)全新的治療靶點(diǎn)，并且作為評(píng)估膀胱癌預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　方法：
　　一、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)膀胱尿路上皮癌細(xì)胞細(xì)以及臨床組織標(biāo)本中

2、miR-130b的表達(dá)情況，以及miR-130b表達(dá)與膀胱癌臨床進(jìn)展之間的相關(guān)性分析
　　我們檢測(cè)分析了正常尿路上皮細(xì)胞系SV以及六種不同膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系中miR-130b的表達(dá)，以及30例正常癌旁和60例膀胱癌組織標(biāo)本中miR-130b的表達(dá)水平。同時(shí)，我們分析了miR-130b表達(dá)水平與臨床資料之間的相關(guān)性。
　　二、通過(guò)CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)以及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-130b對(duì)膀胱癌細(xì)胞

3、系增殖能力的影響，Transwel l實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-130b對(duì)膀胱癌細(xì)胞系侵襲和遷移能力的影響
　　我們通過(guò)CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)以及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-130b對(duì)膀胱癌細(xì)胞系增殖能力的影響，并且通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-130b對(duì)膀胱癌細(xì)胞系侵襲和遷移能力的影響
　　三、通過(guò)生物信息學(xué)軟件，分析miR-130b的啟動(dòng)子區(qū)域，并且通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析NF-κ B信號(hào)的活化與mi R-

4、130b表達(dá)之間的關(guān)系
　　我們通過(guò)生物信息學(xué)軟件PromoterScan、Jaspar、Promoter2.0和Chipbase，分析了miR-130b的啟動(dòng)子區(qū)域，找到了潛在的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。并且通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分析了NF-κB信號(hào)的活化與miR-130b表達(dá)之間的關(guān)系。
　　四、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析NF-κ B與miR-130b之間的結(jié)合關(guān)系
　　我們構(gòu)建了包含miR-130b啟動(dòng)子

5、野生型和突變型的報(bào)告基因質(zhì)粒，并且通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，分析了NF-κB與miR-130b之間的結(jié)合關(guān)系。
　　五、通過(guò)生物信息學(xué)分析手段，預(yù)測(cè)miR-130b的下游靶基因，通過(guò)蛋白免疫印記、實(shí)時(shí)定量PCR和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析miR-130b與CYLD之間的調(diào)控關(guān)系，并且進(jìn)一步研究miR-130b影響NF-κ B活性的機(jī)制
　　我們通過(guò)生物信息學(xué)軟件TargetScan，分析了miR-13

6、0b的下游靶基因，找到了CYLD作為研究對(duì)象，并且通過(guò)免疫印記法、實(shí)時(shí)定量PCR和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，分析了miR-130b與CYLD之間的調(diào)控關(guān)系。并且，我們通過(guò)CYLD回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步分析了miR-130b對(duì)NF-κB活性影響的機(jī)制。
　　六、臨床組織標(biāo)本中檢測(cè)NF-κ B，mi R-130b以及CYLD之間的表達(dá)相關(guān)性
　　我們檢測(cè)了10個(gè)膀胱癌臨床組織標(biāo)本中，NF-κB，miR-130b以及CYLD的表達(dá)水平，并

7、且通過(guò)Spearman相關(guān)性分析，研究了三者之間的表達(dá)相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　一、miR-130b在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系及組織中高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌臨床進(jìn)展呈正相關(guān)性
　　我們檢測(cè)了miR-130b在六種BTCC細(xì)胞系及正常尿路上皮細(xì)胞系(SV-HUC-1)中，以及在30個(gè)癌旁正常膀胱黏膜組織及60個(gè)膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)miR-130b在BTCC組織/細(xì)胞系中的表達(dá)要明顯高于正常

8、組織/細(xì)胞系。我們也分析了60例膀胱癌患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)miR-130b的表達(dá)與病理分級(jí)以及腫瘤分期之間具有顯著的相關(guān)性。
　　二、miR-130b在體內(nèi)及體外能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞系的增殖能力
　　我們對(duì)5637和T24這兩種細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染miR-130b agomir、antagomir以及各自的陰性對(duì)照RNA(Negative control，NC)。通過(guò)CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-130b后，

9、細(xì)胞的增殖能力明顯提高，而敲除之后則下降。進(jìn)一步我們使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-130b后細(xì)胞周期明顯向G2/M期進(jìn)展，而敲除之后細(xì)胞周期阻滯在S期。我們通過(guò)裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了miR-130b在體內(nèi)也能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞系的增殖能力。
　　三、miR-130b能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞系的遷移和侵襲能力，并且能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞上皮細(xì)胞一間充質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　我們發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)miR-130b之后，細(xì)胞的侵襲能力和遷

10、移能力均明顯升高，而敲除之后則出現(xiàn)下降。我們進(jìn)一步分析了膀胱癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化模型，我們檢測(cè)了三種EMT相關(guān)蛋白，分別是E-cadherin、N-cadherin以及Vimentin。我們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-130b能夠提高N-cadherin及Vimentin的蛋白表達(dá)水平，并且降低了E-cadherin的表達(dá);而敲除miR-130b則能夠得到相反的結(jié)果。
　　四、NF-κ B能夠促進(jìn)m iR-130b的表達(dá)
　

11、　我們通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件 PromoterScan,分析了miR-130b的啟動(dòng)子區(qū)域。我們發(fā)現(xiàn)，在其啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)潛在的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。接下類，我們使用TNF-α處理細(xì)胞/BAY11-7082預(yù)處理后再使用TNF-α處理細(xì)胞/轉(zhuǎn)染NF-κB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒這三種方法處理細(xì)胞，并且檢測(cè)了NF-κB的活化情況和miR-130b的表達(dá)變化。我們發(fā)現(xiàn)，NF-κB促進(jìn)了miR-130b的表達(dá)。
　　五、NF-κ B通過(guò)與miR-13

12、0b的啟動(dòng)子結(jié)合直接調(diào)控其表達(dá)
　　我們構(gòu)建了包含miR-130b啟動(dòng)子區(qū)域野生型以及突變型的pmirGLO報(bào)告基因質(zhì)粒。我們先將報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到5637細(xì)胞中，24小時(shí)后，使用TNF-α處理細(xì)胞，再24小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)熒光活性。我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了包含野生型miR-130b啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞，相對(duì)于空白載體，其相對(duì)熒光活性明顯升高，而突變型則無(wú)明顯變化。下一步，我們針對(duì)這三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了三組特異性引物，并且通過(guò)染色

13、質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，將沉淀的DNA片段，通過(guò)這三組特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照(IgG)，沉淀DNA中，結(jié)合位點(diǎn)1和3的含量明顯被富集，而在使用TNF-α處理后，這兩個(gè)位點(diǎn)的含量能夠進(jìn)一步升高。
　　六、miR-130b能夠通過(guò)直接與CYLD的3' UTR結(jié)合，來(lái)抑制CYLD的基因和蛋白表達(dá)
　　我們使用TargetScan軟件對(duì)miR-130b的下游靶基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)CYLD的3'UTR與miR

14、-130b高度匹配，并且是保守的。我們通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-130b agomir能夠抑制轉(zhuǎn)染了含有野生型CYLD3'UTR報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞的熒光活性，而對(duì)于突變型則沒(méi)有效果。我們分別對(duì)5637和T24細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了miR-130b agomir、antagomir以及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照，并通過(guò)免疫印記法，檢測(cè)CYLD和NF-κB的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了miR-130bagomir后，CYLD的基因和蛋白表達(dá)水平均下

15、降，而細(xì)胞核中NF-κB的表達(dá)水平則出現(xiàn)升高;轉(zhuǎn)染miR-130b antagomir則出現(xiàn)相反結(jié)果。
　　七、miR-130b是通過(guò)抑制CYLD的表達(dá)而促進(jìn)了NF-κ B的活化
　　我們使用了pcDNA-CYLD質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行CYLD的回復(fù)，我們共轉(zhuǎn)染miR-130bagomir/pcDNA-Vector以敲除CYLD，共轉(zhuǎn)染miR-130b agomir/pcDNA-CYLD以實(shí)現(xiàn)對(duì)CYLD的回復(fù)。并且檢測(cè)了p-IKK、IK

16、K、IκB、CYLD以及NF-κB的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-130b agomir抑制了CYLD的表達(dá)，促進(jìn)了IKK的磷酸化以及IκB的降解。而回復(fù)了CYLD之后，這些蛋白的變化也得到了回復(fù)。這說(shuō)明了，miR-130b是通過(guò)抑制CYLD表達(dá)，促進(jìn)了NF-κB的活化。
　　八、臨床組織標(biāo)本中檢測(cè)NF-κ B、miR-130b以及CYLD的表達(dá)，以及相關(guān)性分析
　　我們?cè)谑畟€(gè)膀胱癌組織標(biāo)本中，檢測(cè)了NF-κB、miR-1

17、30b以及CYLD的表達(dá)情況，并且對(duì)結(jié)果進(jìn)行了Spearmen相關(guān)性分析。我們發(fā)現(xiàn)，NF-κB與miR-130b表達(dá)呈正相關(guān)，而miR-130b與CYLD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　miR-130b在膀胱癌中是一個(gè)促癌基因，它能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并且它的表達(dá)水平與膀胱癌的臨床進(jìn)展具有一定的正相關(guān)性。NF-κB能夠通過(guò)與miR-130b啟動(dòng)子直接結(jié)合，從而促進(jìn)miR-130b的表達(dá);而CYLD，一個(gè)N