雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑誘導人肺腺癌H1299細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、目的：肺癌的發(fā)病率及相關死亡率在目前全球癌癥中所占比例最高。其中80％的肺癌病人為非小細胞肺癌（NSCLC）。目前臨床一線使用的含鉑化療方案有效率僅有30%。因此，大家迫切的需要找到一種新的化療藥物來提高肺癌病人的治療效率。近年的許多研究中，青蒿素及其衍生物在一些對其他藥物敏感及耐藥的腫瘤細胞株中均展現(xiàn)出了強大的抗癌活性。雙氫青蒿素（DHA）—一種已知的青蒿素的衍生物，這些年來，它的抗癌活性在世界范圍內(nèi)被各國學者廣泛研究。而雙氫青蒿素也

2、展現(xiàn)出了對腫瘤細胞株如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、乳腺癌細胞、結(jié)腸癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、胰腺癌細胞的抗癌作用。大量的研究表明許多腫瘤細胞p53基因的缺失或未表達均與化療的耐藥有關。但迄今為止，尚未查到關于雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑（Cis）作用于p53缺失型人肺腺癌H1299細胞系的相關研究。而這項實驗的設計初衷就是研究雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑誘導H1299細胞凋亡的協(xié)同作用及其潛在的作用機制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)人類肺腺癌H129

3、9細胞并將細胞分為四組：雙氫青蒿素（DHA）組、順鉑（Cis）組、聯(lián)合用藥組及對照組，通過四甲基偶氮唑鹽/噻唑藍（MTT）實驗來評價不同處理組間H1299細胞抑制率的變化情況。
　　2.采用p53基因正常表達的A549細胞作為對照，通過MTT實驗比較在相同藥物處理條件下，DHA及Cis分別對A549細胞和H1299細胞抑制率的影響。
　　3.采用流式細胞術(shù)（FCM）來評價DHA作用不同時間、劑量的情況下，對H1299細胞的凋

4、亡率的影響。
　　4.通過赫斯特33258（Hoechst33258）對細胞核染色來觀察經(jīng)DHA處理后H1299細胞核的形態(tài)變化。
　　5.通過蛋白印跡法（Western Blot）和逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）來評價凋亡相關通路蛋白及基因的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.MTT實驗和Hoechst33258細胞核染色實驗顯示隨著各自藥物濃度的增加以及作用時間的延長雙氫青蒿素和順鉑單藥處理組細胞凋

5、亡率明顯增加，聯(lián)合用藥處理組的細胞凋亡率更高。另一個MTT實驗結(jié)果顯示：相同濃度的Cis孵育A549及H1299兩組細胞48小時后，對A549細胞的抑制率明顯高于對H1299細胞的抑制率。于此相反，使用相同濃度的DHA孵育上述兩組細胞48小時后，兩組間的細胞抑制率均無明顯差異；
　　2.流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示當DHA濃度為20μM時，H1299細胞的凋亡率從9.09%（對照組）上升至17.07%（24小時）以及24.31%（48小時

6、）；當DHA作用于相同時間（24小時），其引起細胞的凋亡率從9.09%（對照組）上升至17.07%（濃度為20μM）以及22.5%（濃度為40μM）；
　　3.RT-qPCR的結(jié)果顯示單藥DHA（20μM）、Cis（12.5μM）及兩藥聯(lián)合孵育24小時及48小時，H1299細胞中半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、-8、-9mRNA的表達均上調(diào)，其中聯(lián)合用藥組Caspase-3，-8，-9的2-??Ct值高于單藥組，而單藥組

7、Caspase3，8，9的2-??Ct值高于對照組；
　　4.Western Blot結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組能顯著提高Caspase-8，-9，-3，-6，-7和多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的活性。提前在H1299細胞中加入Caspase-3、-8、-9抑制劑后，再次通過Western Blot實驗觀察這三個蛋白的表達情況，結(jié)果表明提前加入zDQMD-fmk組的細胞，Cleave-caspase-3的表達明顯降低，但是Cleav

8、e-caspase-8、-9的表達無明顯變化。而提前加入zIETD-fmk組的細胞，顯著降低了Cleave-caspase-8的表達，部分降低了Cleave-caspase-3、-9的表達。提前孵育zLEHD-fmk組的細胞Cleave-caspase-9的表達顯著降低，Cleave-caspase-3的表達部分降低，而Cleave-caspase-8的表達基本無變化。
　　結(jié)論：
　　1.DHA作用于H1299細胞能誘導時

9、間及劑量依賴性細胞毒性。
　　2.DHA作用于H1299細胞能誘導時間及劑量依賴性的細胞凋亡。
　　3.DHA聯(lián)合Cis作用于H1299細胞有協(xié)同促凋亡作用。
　　4.Caspase-8參與的死亡受體信號通路及Caspase-9參與的線粒體信號通路與DHA及CIS聯(lián)合用藥產(chǎn)生的協(xié)同作用有關。
　　5.DHA及Cis單藥及聯(lián)合用藥均能上調(diào)H1299細胞Caspase-3，-8，-9mRNA的表達。
　　綜上所