青蒿琥酯誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡是一種高度有序的程序性死亡的方式，它主要通過(guò)兩條途徑來(lái)啟動(dòng)：死亡受體途徑和線粒體介導(dǎo)的途徑。這兩條途徑都會(huì)活化下游的死亡執(zhí)行者caspase-3，因此如何更好地監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性成為了一個(gè)關(guān)注點(diǎn)。近年來(lái)，天然的植物提取藥，特別是傳統(tǒng)中藥的藥用植物的潛力已經(jīng)得到廣泛承認(rèn)。雖然前人付出了很多努力研究青蒿琥酯的抗腫瘤機(jī)制，但是青蒿琥酯對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制仍然不清楚。
　　 本文第一章緒論部分總結(jié)了凋亡信號(hào)

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究現(xiàn)狀，概述了青蒿琥酯誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）與熒光壽命成像（FLIM）的基本原理及其應(yīng)用，同時(shí)說(shuō)明了本課題研究的目的和意義。
　　 本文的實(shí)驗(yàn)工作主要分為兩個(gè)部分：
　　 在第一部分的實(shí)驗(yàn)工作中，本文利用雙光子激發(fā)的熒光壽命成像和熒光光譜成像這兩種方法在抗癌藥物誘導(dǎo)的人類肺腺癌（ASTC-a-1）細(xì)胞死亡的過(guò)程中分析單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活化。SCAT3是基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移（

3、FRET）技術(shù)構(gòu)建的caspase-3的探針，在穩(wěn)定表達(dá)SCAT3的活細(xì)胞內(nèi)對(duì)其進(jìn)行雙光子發(fā)射光譜成像。通過(guò)測(cè)量發(fā)射光譜的兩個(gè)峰的比值（526 nm/476 nm）得到780 nm波長(zhǎng)可以選擇性地激發(fā)SCAT3供體中的ECFP。采用星孢菌素和蟾蜍靈處理細(xì)胞后，與對(duì)照細(xì)胞相比，526 nm譜峰明顯下降，476 nm譜峰明顯上升，而經(jīng)過(guò)紫杉醇處理后，SCAT3熒光光譜沒(méi)有明顯的變化，表明星孢菌素和蟾蜍靈誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活化，

4、而紫杉醇并沒(méi)有活化caspase-3。然后，運(yùn)用熒光壽命成像的方法測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)ECFP的熒光壽命。經(jīng)過(guò)紫杉醇處理后供體ECFP的熒光壽命與對(duì)照組一致，都為1.83±0.02 ns，而經(jīng)過(guò)星孢菌素和蟾蜍靈處理后分別顯著性地上升到2.05±0.03 ns和1.90±0.03 ns，SCAT3的FRET效率也由對(duì)照組的24.38％分別下降到15.29％和21.49％，表明細(xì)胞內(nèi)的SCAT3被切割釋放了ECFP，進(jìn)一步證明了星孢菌素和蟾蜍靈細(xì)胞

5、內(nèi)caspase-3的活化，而紫杉醇則沒(méi)有。同時(shí)，雙光子激發(fā)的熒光壽命和熒光光譜成像也被證明是兩種檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)caspase-3活化的可行的方法。
　　 在第二部分的實(shí)驗(yàn)工作中，我們第一次證明在青蒿琥酯誘導(dǎo)的ROS介導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，青蒿琥酯誘導(dǎo)了Smac，AIF從線粒體中的釋放，而cytochrome c和caspase-9并沒(méi)有參與此過(guò)程。CCK-8和流式細(xì)胞儀的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示抗氧化劑NAC能夠減弱青蒿琥酯誘導(dǎo)的細(xì)胞

6、死亡和磷脂酰絲氨酸的外翻，證明了青蒿琥酯誘導(dǎo)了ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡?；贔RET的質(zhì)粒FRET-Bid，SCAT9和SCAT3，在青蒿琥酯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，我們檢測(cè)了活細(xì)胞內(nèi)caspase-8，caspase-9和caspase-3的活性，證明了青蒿琥酯誘導(dǎo)了caspase-8和-easpase-3的活化，但并沒(méi)有活化caspase-9。本文進(jìn)一步運(yùn)用熒光底物和western blotting的方法加以驗(yàn)證了這些結(jié)果。共聚焦成像和w