低氧損傷下PC12細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系研究.pdf

1、第一部分：低氧損傷誘導(dǎo) PC12細(xì)胞自噬激活
　　目的：
　　初步探討在低氧損傷下神經(jīng)元樣腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）自噬的發(fā)生情況。
　　方法：
　　通過低氧培養(yǎng)箱建立細(xì)胞低氧損傷模型；構(gòu)建GFP-LC3質(zhì)粒；分別在給予或者不給予溶酶體質(zhì)子泵抑制劑Baf A1的情況下，通過western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；RT-PCR法檢測自噬小體表面微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）mRNA水平的表達(dá)；激

2、光共聚焦顯微鏡檢測LC3的表達(dá)及分布變化。統(tǒng)計學(xué)分析低氧損傷與細(xì)胞自噬之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　western blot結(jié)果顯示，低氧損傷下，PC12細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯隨著低氧時間的延長而增加，24小時后出現(xiàn)下降；RT-PCR結(jié)果顯示，低氧損傷下，LC3的mRNA水平明顯上調(diào)；激光共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果顯示，低氧損傷下，細(xì)胞內(nèi)含有GFP-LC3顆粒的自噬小體明顯增多。自噬的發(fā)生與低氧損傷之間存在相關(guān)性。
　　

3、結(jié)論：
　　低氧損傷能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生自噬，兩者之間存在相關(guān)性。
　　第二部分：自噬激活在低氧損傷中的作用及其機(jī)制
　　目的：
　　以對低氧敏感的神經(jīng)元樣PC12細(xì)胞為低氧損傷模型，探討低氧誘導(dǎo)的自噬激活在低氧損傷中發(fā)揮的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　通過低氧培養(yǎng)箱建立細(xì)胞低氧損傷模型；體外給予細(xì)胞自噬抑制劑3-MA，通過MTT方法檢測細(xì)胞活力；LDH法檢測細(xì)胞毒性；PI染色檢測細(xì)胞死亡情況；c

4、aspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3的活性；western blot方法檢測caspase-3的活性形式cleaved caspase-3的表達(dá)變化。統(tǒng)計學(xué)分析低氧損傷下抑制細(xì)胞自噬后細(xì)胞活力及凋亡變化及其相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　MTT結(jié)果顯示給予自噬抑制劑3-MA后，低氧損傷的細(xì)胞活力進(jìn)一步降低；LDH結(jié)果顯示給予自噬抑制劑3-MA后，低氧損傷的細(xì)胞細(xì)胞毒性進(jìn)一步增強(qiáng)；PI染色結(jié)果顯示給予自噬抑制劑3-M

5、A后，低氧損傷的細(xì)胞死亡進(jìn)一步增多；并且caspase-3的活性及活性形式表達(dá)檢測結(jié)果顯示，給予自噬抑制劑3-MA后，caspase-3的活性增強(qiáng)，其活性表達(dá)形式cleaved caspase-3的表達(dá)增多。
　　結(jié)論：
　　低氧損傷下，自噬發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與抑制凋亡有關(guān)。
　　第三部分：凋亡抑制自噬活動
　　目的：
　　低氧損傷24小時后自噬活動逐漸減弱，而凋亡活動逐漸增強(qiáng)。凋亡對自噬是

6、否影響及其可能的機(jī)制尚不完全明了。本研究目的是初步探討低氧損傷的后期凋亡的增強(qiáng)是否導(dǎo)致自噬的減弱，兩者之間是否存在相關(guān)性。
　　方法：
　　通過低氧培養(yǎng)箱建立細(xì)胞低氧損傷模型；構(gòu)建Flag-Bax WT，F(xiàn)lag-Bax S184V和Flag-BaxΔC過表達(dá)質(zhì)粒；將EGFP-LC3分別與Flag-Bax WT（或Flag-Bax S184V，F(xiàn)lag-BaxΔC）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的變化；

7、給予細(xì)胞凋亡抑制劑z-VAD-FMK，蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑氯喹，western blot檢測共轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)LC3表達(dá)的變化；細(xì)胞低氧時給予細(xì)胞凋亡抑制劑z-VAD-FMK，western blot檢測LC3表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　western blot結(jié)果顯示，當(dāng) EGFP-LC3與野生型 Flag-Bax WT或激活性Flag-Bax S184V質(zhì)粒共轉(zhuǎn)時其表達(dá)明顯減少，而與突變型Flag-BaxΔC