Rho激酶和磷酸二酯酶對環(huán)核苷酸依賴性血管舒張作用的調節(jié).pdf

1、環(huán)核苷酸包括環(huán)-磷酸腺苷(cAMP,或稱環(huán)腺苷酸)和環(huán)-磷酸鳥苷(cGMP,或稱環(huán)鳥苷酸)。作為第二信使物質,它們在機體組織細胞的生物活性中起著重要作用。在血管,其胞內(nèi)濃度的改變直接影響血管平滑肌的反應性。cAMP由ATP通過腺苷酸環(huán)化酶的作用而生成。腺苷酸環(huán)化酶既可以通過與之偶聯(lián)的β腎上腺素受體激活(異丙腎上腺素為該受體的激動劑),又可以被其激活劑(forskolin)直接激活,從而影響細胞內(nèi)cAMP的水平。作為一種強效β腎上腺素受體

2、激動劑,異丙腎上腺素(isoprenaline)不僅使血管平滑肌細胞內(nèi)的cAMP濃度增加,還可以作用于內(nèi)皮細胞,通過cAMP的作用最終激活eNOS-NO-cGMP信息通路,產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性作用,使血管舒張。cGMP要依靠鳥苷酸環(huán)化酶的作用,由GTP生成。在血管,鳥苷酸環(huán)化酶的激活通常需要內(nèi)、外源性NO的作用,也就是說,內(nèi)皮細胞的eNOS可以被乙酰膽堿(acetylcholine)或其他內(nèi)皮依賴性舒血管物質激活,使NO生成增加:另外,硝普鈉

3、、硝酸甘油等作為NO供體,可以直接釋放NO。NO擴散至血管平滑肌細胞,激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC),進而增加cGMP在胞內(nèi)的水平。cAMP和cGMP濃度增加的結果是降低胞內(nèi)鈣離子的濃度或其敏感性,或者通過其他機制最終引起血管舒張。同時,二者濃度也受其水解酶磷酸二酯酶(PDE)的影響。研究發(fā)現(xiàn),某些生理病理情況會導致PDE活性的異常,從而直接改變血管的舒張狀態(tài)。
　　 目前,NO供體被廣泛用于心血管疾病的治療,諸如動脈粥樣硬化

4、、高血壓、冠心病等。但是,治療過程中出現(xiàn)的硝酸甘油耐受大大限制了該藥的臨床應用。因此,深入了解耐受產(chǎn)生的機制并探尋合理有效的防治措施,成為亟待研究的課題。在某些病理生理情況下,血栓素(TxA2)的生成增加,該物質會通過TP受體(thromboxane-prostanoidreceptor)激活Rho/Rho激酶通路,引發(fā)鈣敏感化或抑制NO產(chǎn)生,使血管功能發(fā)生異常改變。但是,這種異常改變對cAMP調節(jié)的血管舒張作用有何影響還未見報道。

5、r>　　 因此,在本實驗中,我們選取大鼠雙側頸總動脈和胸主動脈為觀察對象,分別用myograph和organbath的方法對血管張力進行測定;用激光共聚焦方法對原代培養(yǎng)的大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞胞內(nèi)一氧化氮和鈣離子濃度進行測定;用ELISA試劑盒檢測血管組織內(nèi)環(huán)核苷酸的水平;并用免疫印跡方法對蛋白水平進行檢測,旨在觀察:激活TP受體對cAMP調節(jié)的內(nèi)皮依賴性和內(nèi)皮非依賴性血管舒張的影響并探討Rho激酶和PDE從中的作用;新型PDE5抑制劑

6、T156對硝酸甘油耐受的影響以及作用機制是否和增加血管組織內(nèi)cGMP水平有關。本課題研究對于進一步揭示某些病理生理情況下血管功能損傷的機制和預防具有重要的意義;并為PDE5抑制劑用于防治硝酸酯類耐受,提高抗缺血藥應用的臨床效果提供理論依據(jù)。
　　 本實驗研究證實:1)Isoprenaline引起內(nèi)皮依賴性血管舒張,用L-NAME或ODQ阻斷NO通路后,isoprenaline的內(nèi)皮依賴性舒血管作用消失;U46619(3*10罐M

7、,1*10-7M,3*10-7M)濃度依賴性地抑制isoprenaline引起的血管舒張,并且這一抑制作用被TP受體阻斷劑S18886(0.3μM)完全阻斷;在內(nèi)皮功能完好的血管,Rho激酶抑制劑Y27632和HA1077部分翻轉了U46619對isoprenaline引發(fā)血管舒張的抑制作用;但是,在去除內(nèi)皮的血管,兩種藥物卻對U46619的抑制血管舒張作用無明顯影響;當把NO通路(L-NAME或者ODQ)阻斷后,U46619對血管舒張

8、的抑制作用不再能被Rho激酶抑制劑(Y27632,HA1077)所翻轉。通過原代培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞研究證實,isoprenaline(1*10-7M)可以引起內(nèi)皮細胞NO產(chǎn)生增加和細胞內(nèi)鈣離子濃度增加,isoprenaline促進NO生成的作用被L-NAME阻斷;U46619(1*10-7M)對isoprenaline引起的NO產(chǎn)生和鈣增加均有抑制作用,并且這一抑制作用被TP受體阻斷劑S18886阻斷;給予Y27632和U4661

9、9預孵20分鐘,然后再給isoprenaline,顯示U46619抑制isoprenaline引起NO生成增加和鈣增加的作用被Y27632不同程度翻轉。通過免疫印跡實驗證明,U46619(1*10-7M)對isoprenaline(1*10-7M)引起的e-NOS磷酸化有抑制作用,并且這一作用被Y27632部分翻轉。
　　 2)在去除內(nèi)皮的血管,isoprenaline和forskolin(兩種增加細胞內(nèi)cAMP水平的藥物)均可

10、引起血管濃度依賴性舒張;U46619(3*10-8M,1*10-7M,3*10-7M)濃度依賴性地抑制上述兩種藥物的舒血管作用,并且這種抑制作用均被TP受體阻斷劑S18886(0.3μM)阻斷;Rho激酶抑制劑Y27632顯著增強了被U46619抑制的舒血管效應;PDE3和PDE4抑制劑(cilostazol和rolipram),非選擇性PDE抑制劑(IBMX)均部分翻轉了U46619對血管舒張的抑制作用;但是,在沒有U46619激活T

11、P受體和Rho激酶的情況下,cilostazol和roliprarn不能影響isoprenaline引發(fā)的血管舒張。cAMP測量結果顯示,isoprenaline和forskolin均可引起血管組織內(nèi)cAMP水平升高;U46619預處理抑制了這兩種藥物引起的cAMP濃度增加;并且這種抑制作用被PDE3、PDE4和Rho激酶抑制劑(cilostazol、rolipram和Y27632)所翻轉。
　　 3)將內(nèi)皮完好和去除內(nèi)皮的大鼠

12、離體主動脈環(huán)在硝酸甘油中預孵90分鐘,均可以誘導血管產(chǎn)生“硝酸甘油耐受”,即血管對硝酸甘油的舒張反應減弱;新型PDE5抑制劑T0156濃度依賴性地抑制了硝酸甘油耐受的形成,使產(chǎn)生耐受的血管舒張反應顯著增強;在未產(chǎn)生耐受的血管,T0156也能使舒張反應增強,但改變幅度要明顯弱于產(chǎn)生耐受的血管;cGMP測量結果也顯示,當血管發(fā)生耐受時,與非耐受情況下相比,cGMP濃度顯著降低;T0156作用結果使cGMP濃度明顯增加,但耐受情況下cGMP濃

13、度增加約為11.6倍,非耐受情況下增加約為6.6倍;在我們的實驗條件下,TxA2受體拮抗劑S18886,內(nèi)皮素受體拮抗劑BQ610以及非選擇性環(huán)氧合酶抑制劑indomethacin對硝酸甘油耐受的形成都沒有影響。
　　 綜上所述,通過本研究課題,可得出以下結論:
　　 1)TP受體激活可抑制isoprenaline的內(nèi)皮依賴性舒張血管作用,這種抑制作用可能與Rho激酶被激活減少血管內(nèi)皮細胞鈣離子內(nèi)流和磷酸化eNOS的水平