SIRT1-ΔExon8和SIRT1-FL對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響.pdf

1、氧化應(yīng)激是多種疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，許多器官損害及腫瘤疾病與氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷、致癌作用有著密切的聯(lián)系。氧化應(yīng)激反應(yīng)可以產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species, ROS），ROS包括各種氧自由基，其中H2O2是它的主要成員，可通過破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)，尤其是基因組與線粒體中的 DNA，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死。由于H2O2能夠有效提高細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，模擬體內(nèi)的氧自由基的損傷情況，而被廣泛用于建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模

2、型。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator1, SIRT1）是一種在哺乳動(dòng)物中首先被發(fā)現(xiàn)的具有去乙?；富钚缘?Sirtuin蛋白家族成員，這一家族屬于第Ⅲ類組蛋白去乙?；福℉DAC），也是目前研究最多、最為深入的Sirtuin蛋白。SIRT1可以通過對(duì)其底物分子如P53、PGC-1α、PCAF、FOXO、P300等的去乙酰化作用，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控、能量代謝和細(xì)胞凋亡等過

3、程。
　　大量研究表明，SIRT1參與調(diào)控細(xì)胞的氧化應(yīng)激影響細(xì)胞的存活。已知SIRT1在多種與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞存活的作用，提示SIRT1是一個(gè)抑制氧化應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞存活的正性調(diào)控因子。但也有研究指出，激活SIRT1可能加重氧化應(yīng)激損傷，對(duì)細(xì)胞的存活發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。因此，有關(guān)SIRT1與抗氧化應(yīng)激作用的研究現(xiàn)狀是，SIRT1具有調(diào)控氧化應(yīng)激的能力，但SIRT1究竟是起正性還是負(fù)性調(diào)控作用，目前尚無統(tǒng)一定論。

4、
　　2010年Lynch等研究發(fā)現(xiàn)人類及小鼠的SIRT1存在缺失第8個(gè)外顯子的選擇性剪接異構(gòu)體（SIRT1-△Exon8）。缺失第8個(gè)外顯子的 SIRT1-△Exon8，共缺失558個(gè)堿基，與SIRT1全長（SIRT1-Full-Length, SIRT1-FL）相比，其去乙?；富钚越档?。而且，SIRT1-△Exon8的表達(dá)比SIRT1-FL的表達(dá)對(duì)外界應(yīng)激刺激更為敏感，例如紫外照射后SIRT1-△Exon8的表達(dá)量呈劑量依賴

5、性增高，而SIRT1-FL經(jīng)紫外刺激后變化不明顯。以上結(jié)果提示，SIRT1-△Exon8的生物學(xué)作用及其表達(dá)調(diào)控可能與SIRT1-FL存在顯著的差異。
　　因此，本研究我們采用H2O2誘導(dǎo)的293T細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，分別觀察SIRT1的兩種不同產(chǎn)物即SIRT1-FL及SIRT1-△Exon8在氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮的不同作用。至此為研究SIRT1的不同功能提供了一個(gè)新的視角，并且可能為之前有關(guān)SIRT1在同樣應(yīng)激損傷條件下發(fā)揮不同

6、作用的矛盾結(jié)論提供一個(gè)合理的解釋。
　　目的：
　　1：通過觀察缺失第八外顯子的 SIRT1選擇性剪接變異體（SIRT1-ΔExon8）和SIRT1全長（SIRT1-FL）的mRNA在H2O2誘導(dǎo)的293T細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中的表達(dá)水平變化，初步探討SIRT1-ΔExon8和SIRT1-FL在細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用。
　　2：通過觀察干擾SIRT1-ΔExon8和過表達(dá)SIRT1-FL后對(duì)H2O2引起的細(xì)胞損傷的影

7、響，進(jìn)一步明確SIRT1-ΔExon8和SIRT1-FL在細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮的不同作用。
　　方法：
　　第一部分實(shí)驗(yàn)分組為：正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。正常對(duì)照組是指H2O2濃度為0μM，實(shí)驗(yàn)組是指H2O2濃度分別為50μM、100μM、200μM、400μM、800μM。分別以不同濃度的H2O2處理293T細(xì)胞3小時(shí)，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，采用CCK-8法和LDH的釋放檢測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)

8、胞內(nèi)活性氧簇（ROS）水平，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon8 mRNA的表達(dá)水平。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)分組為：正常對(duì)照組、空白質(zhì)粒組、SIRT1-ΔExon8干擾組、SIRT1-FL過表達(dá)組。利用 phMGFP載體構(gòu)建空白質(zhì)粒、SIRT1-ΔExon8干擾質(zhì)粒和SIRT1-FL過表達(dá)質(zhì)粒，將空白質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒及過表達(dá)質(zhì)粒通過質(zhì)粒提取試劑盒及轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。給予H2O2作用3小時(shí)后，分別檢測(cè)細(xì)

9、胞毒性指標(biāo)、凋亡指標(biāo)及細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度的H2O2（50μM、100μM、200μM、400μM、800μM）作用，可劑量依賴性的引起細(xì)胞活力下降，LDH釋放量增加，細(xì)胞凋亡率增高，細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加；同樣可劑量依賴性的引起SIRT1-FL mRNA表達(dá)水平降低，SIRT1-ΔExon8 mRNA的表達(dá)水平增高。
　　2、過表達(dá)SIRT1-FL及干擾SIRT1-ΔExon8，均可抑制H2

10、O2（400μM）引起的細(xì)胞活力下降以及LDH的釋放，降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率和胞內(nèi)ROS含量。
　　結(jié)論：
　　1、隨著H2O2濃度的不斷增高，SIRT1-FL mRNA表達(dá)水平逐漸降低而SIRT1-ΔExon8 mRNA表達(dá)水平逐漸增高，由此引起的細(xì)胞損傷逐漸加重且細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸增多，因此間接提示 SIRT1-ΔExon8可能促進(jìn)了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，而SIRT1-FL則抑制了細(xì)胞氧化損傷。
　　2

11、、干擾SIRT1-ΔExon8或過表達(dá)SIRT1-FL都可拮抗H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性及凋亡，進(jìn)一步明確了SIRT1-ΔExon8可能促進(jìn)了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷而SIRT1-FL發(fā)揮相反的作用。
　　3、干擾SIRT1-ΔExon8或過表達(dá)SIRT1-FL都可使H2O2誘導(dǎo)生成的ROS含量降低，提示 SIRT1-△Exon8可能通過使胞內(nèi) ROS水平增高促進(jìn)細(xì)胞的氧化損傷，而SIRT1-FL可能通過降低胞內(nèi)ROS水平發(fā)揮抗氧化損傷作用