NA蛋白影響H3N2亞型犬流感病毒復制的分子機制.pdf

1、2007年以來，亞洲新發(fā)H3N2亞型犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)在我國廣泛流行，引起犬急性傳染病—犬流感。研究發(fā)現(xiàn)，H3N2CIV來源于禽源H3N2亞型流感病毒，經變異演化后感染的犬。早期的實驗結果表明，H3N2CIV可通過空氣在犬間傳播，也可繼續(xù)感染其它哺乳動物，包括鼠和豚鼠，但喪失對禽的感染力。禽源的H3N2CIV對犬的致病機制到底如何，目前尚不清楚。HA和NA基因在流感病毒的致病方面起著重要作

2、用。鑒于此，本研究用禽源病毒的HA或NA單基因替換掉H3N2CIV的相應基因，并拯救獲得了以H3N2CIV為背景的重組病毒。將這些重組病毒感染BALB/c小鼠，確定了H3N2CIV復制的關鍵基因及其氨基酸位點，并深入探討影響其復制的致病機制，具體內容如下:
　　1.確定H3N2CIV復制的關鍵基因
　　本研究早期篩選到了兩株高度同源的病毒，一株引起犬發(fā)病的犬流感病毒A/canine/influenza virus/01/20

3、10(H3N2)(簡稱為C1)和一株不感染犬發(fā)病的禽流感病毒A/duck/shanghai/06/2009(H3N2)(簡稱為)D6，并建立這兩株病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)。拯救得到與原毒株基因序列一致的重組病毒，分別命名為rC1和rD6。用D6毒株的HA或NA單基因替換C1對應基因，并拯救得到以C1為背景的兩株重組病毒，分別命名為C1-D6HA和C1-D6NA。通過滴鼻途徑感染5周齡BALB/c小鼠，106EID50/只。結果表明，親本毒

4、rC1在鼠的肺臟中復制良好，而C1-D6NA基本上無法復制。同時，通過病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)，感染了rC1毒株的小鼠肺臟有明顯的病理變化，而感染C1-D6NA毒株的小鼠肺臟基本無病理變化。根據(jù)這些結果，我們認為CIV的NA基因可能是該病毒致病的關鍵基因。
　　2.確定H3N2CIV復制的關鍵氨基酸位點
　　利用Lasergene7.0軟件分析和比較了大量H3N2亞型犬流感病毒和同亞型的禽流感病毒的NA序列，最后在CIV的NA蛋白

5、序列上鎖定了4個可疑的氨基酸位點，構建相應的pBD突變質粒，并拯救獲得了4株點突變重組病毒，分別命名為C1-NA(L24M)、C1-NA(K54E)、C1-NA(S154P)和C1-NA(G430R)。小鼠致病性實驗表明，親本毒rC1和C1-NA(L24M)、C1-NA(G430R)病毒在鼠的肺臟上皆能良好復制，但C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)重組病毒無法在鼠肺臟中復制。進一步地犬腎細胞(Madin-Darby can

6、ine kidney，MDCK)增殖試驗結果與鼠的致病性結果相似。因此，我們認為C1-NA的54K和154S可能是H3N2CIV致病的關鍵氨基酸位點。
　　3.H3N2CIV復制的分子機制
　　酶活性是流感病毒NA蛋白重要的功能之一。那么，CIV-NA的54K和154S是否通過調控NA蛋白的酶活性，從而影響H3N2CIV的致病性呢？為此，利用無特異性病原(Specific pathogen free，SPF)雞胚擴增rC1及

7、其NA點突變重組病毒C1-NA(L24M)、C1-NA(K54E)、C1-NA(S154P)和C1-NA(G430R)，檢測NA酶活性。結果發(fā)現(xiàn)重組病毒C1-NA(K54E)和C1-NA(S154P)的NA酶活性明顯低于rC1及其他2株重組病毒C1-NA(L24M)和C1-NA(G430R)，即54K和154S可顯著增強H3N2CW的NA酶活性。這種NA酶活性的改變，是否會影響病毒的釋放呢？為此，我們進行了紅細胞病毒釋放試驗和子代病毒在