模擬昆蟲中腸環(huán)境對球孢白僵菌孢子的影響.pdf

1、作為重要的昆蟲病原真菌,球孢白僵菌(Beauveria bassiana)很難通過口器攝入經(jīng)腸壁侵染寄主,但其機理不明。本研究首先篩選出一株穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化菌株,然后模擬昆蟲中腸環(huán)境處理其兩種孢子,采用流式細胞術檢測處理后孢子熒光強度的變化以反映孢壁的受損程度,并用掃描電子顯微鏡觀測處理后孢壁表面形態(tài),最后測定處理后兩種孢子的萌發(fā)率以反映對孢子活力的影響。主要內(nèi)容和結果分述于下： 遺傳轉(zhuǎn)化菌株的生物學篩選

2、從六個轉(zhuǎn)化子菌株中篩選出能代表野生型菌株生理生化特征的高效表達綠色熒光蛋白的菌株。測定六個轉(zhuǎn)化子菌株的分生孢子熒光強度強弱,結果顯示Bb2860G6是最優(yōu)的熒光強度最強的菌株。耐熱力測定結果顯示,菌株Bb2860G6、Bb2860G12和Bb2860G4在熱脅迫后的殘存活孢率均在55％以上,孢子耐熱力極強。測定Bb2860G0、Bb2860G1、Bb2860G6和Bb2860G8四個菌株的菌落生長情況,Bb2860G1的菌落面積顯著較低

3、,其他三個菌落面積差異不顯著。用Bb2860G0、Bb2860G6和Bb2860G8這三株菌進行對桃蚜的生物測定,結果表明三個菌株的孢子懸液對桃蚜的劑量效應與時間效應都極顯著,Bb2860G6與Bb2860G0的時間效應值接近,殺蚜效應接近。綜合各項生物學篩選指標,最終選取Bb2860G6菌株為最終的研究對象。 模擬昆蟲中腸環(huán)境對分生孢子的影晌配置單一或者復合的模擬昆蟲中腸消化液,使Bb2860G6分生孢子懸浮于其中,恒溫水浴后

4、,采用流式細胞術測定其熒光強度的變化情況,結果顯示：不同濃度的蛋白酶K、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、纖維素酶處理后均引起被檢熒光強度的上升,并呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。α-淀粉酶、蝸牛酶、葡萄糖苷酶、昆布多糖酶處理組只引起被檢熒光強度的輕微變化,并呈現(xiàn)出下降趨勢。經(jīng)兩種復合酶模擬消化液處理后,兩種復合酶液均引起被檢熒光強度的下降,然而下降幅度有所差異：蛋白酶K和纖維素酶引起孢子熒光強度降低8％-21％,胰蛋白酶和纖維素酶導致37％-43％的下

5、降幅度。在pH 5-11范圍內(nèi),兩種復合酶液處理后孢子的相對熒光強度有所下降,分別為對照的53％-72％和77％-97％。電鏡照片顯示熒光強度上升的處理組孢子壁表面蛋白紋路模糊,孢壁變薄；而熒光強度下降的處理組孢壁部分結構不完整,甚至出現(xiàn)孔洞。 測定經(jīng)不同的模擬消化液處理后的分生孢子萌發(fā)率,結果顯示,單一酶模擬消化液處理后分生孢子萌發(fā)率出現(xiàn)不同程度的降低,胰蛋白酶引起萌發(fā)率下降幅度最大(31％)。pH5-11條件下用兩種復合酶模

6、擬消化液處理分生孢子,萌發(fā)率均出現(xiàn)大幅度的降低。胰蛋白酶和纖維素酶組合引起萌發(fā)率下降30-98％,蛋白酶K和纖維素酶組合引起萌發(fā)率下降21-91％。 模擬昆蟲中腸環(huán)境對芽生孢子的影響采用同分生孢子相同的樣品處理方法,使模擬昆蟲中腸消化液作用于Bb2860G6芽生孢子,流式細胞術檢測結果顯示：不同濃度的蛋白酶K、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、纖維素酶處理后均引起被檢熒光強度的上升,但隨濃度增大上升趨勢變化不明顯；經(jīng)昆布多糖酶和α-淀粉酶

7、處理后,熒光強度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；而經(jīng)蝸牛酶、葡萄糖苷酶處理后,隨濃度升高被檢熒光強度呈下降趨勢。經(jīng)兩種復合酶模擬消化液處理后,胰蛋白酶和纖維素酶組合導致熒光強度上升8％-48％,隨酶液濃度的上升,熒光強度上升幅度增大；蛋白酶K和纖維素酶組合則隨酶液濃度上升熒光強度上升幅度減小(10％-3％),1％濃度甚至引起被檢熒光強度下降15％。在pH 5-11范圍內(nèi),兩種復合酶模擬消化液處理后孢子的相對熒光強度有所上升,分別為對照的2.14

8、-1.35倍和1.01-1.36倍。掃描電鏡觀測結果顯示蛋白酶處理后芽生孢子表面未出現(xiàn)明顯變化,而糖苷酶類處理后孢子表面不再光滑平整,被消減而變得不平。 測定經(jīng)不同的酶液處理后的分生孢子萌發(fā)率,結果表明,單一酶模擬消化液處理后芽生孢子萌發(fā)率出現(xiàn)不同程度的降低。其中,昆布多糖酶引起萌發(fā)率下降幅度最大(30％)。pH5-11條件下胰蛋白酶和纖維素酶組合引起萌發(fā)率下降49-78％,蛋白酶K和纖維素酶引起萌發(fā)率下降43％-67％。