P2X7受體介導(dǎo)的HEK293細(xì)胞活化與凋亡機(jī)理研究.pdf

1、嘌呤受體分為P1和P2兩大類。P1受體主要由A(腺苷)激活，P2受體主要由ATP等激活。P2受體主要又分為P2X和P2Y。P2X受體家族是一類對(duì)鉀、鈉和鈣可通透的離子通道，P2Y受體家族是與G-蛋白相偶連的受體，與磷脂酶C的激活和肌醇三磷酸的形成有關(guān)。目前已克隆出7個(gè)不同的P2X亞型，分別稱為P2X1-7，P2X7又稱P2Z。P2X7受體特性與其他六個(gè)亞型不同；體外電生理實(shí)驗(yàn)表明ATP短暫刺激該受體可引起非選擇性小陽(yáng)離子瞬時(shí)通透；如果A

2、TP反復(fù)或持續(xù)刺激該受體既可引起非選擇性質(zhì)膜孔道開放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。雖然P2受體廣泛地分布機(jī)體各組織器官，以往認(rèn)為P2X7是唯一被證實(shí)分布于小膠質(zhì)細(xì)胞的P2嘌呤受體。目前免役組織化學(xué)一般檢測(cè)不出來(lái)，正常條件下免疫組織化學(xué)顯示出的陽(yáng)性細(xì)胞一般為神經(jīng)細(xì)胞，而且比較淺淡。細(xì)胞外ATP可通過(guò)P2X受體可以激活膠質(zhì)細(xì)胞。在體內(nèi)，細(xì)胞外ATP濃度很低，不足以激活膠質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)更多的P2X受體。而細(xì)胞內(nèi)ATP濃度較高，后者是前者的1000倍，達(dá)毫

3、摩爾水平。在某些病理?xiàng)l件下如腦外傷、缺血、炎癥等局部細(xì)胞受到損傷而釋放出大量ATP及降解產(chǎn)物，它們?cè)诰植康臐舛群芨?，而且?huì)向鄰近區(qū)域擴(kuò)散，它們將較長(zhǎng)時(shí)間地刺激損傷區(qū)和其鄰近區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞，這足以激活膠質(zhì)細(xì)胞，并使其P2X受體表達(dá)上調(diào)。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后可肥大、增生，形成典型的吞噬細(xì)胞，可產(chǎn)生許多生物活性物質(zhì)如活性氧、一氧化氮、蛋白酶及一些炎性物質(zhì)對(duì)周圍細(xì)胞產(chǎn)生損害作用；但另一方面又產(chǎn)生轉(zhuǎn)化因子beta1和神經(jīng)生長(zhǎng)因子等物質(zhì)促進(jìn)神經(jīng)組織再生及

4、修復(fù)?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞在腦外傷、缺血、炎癥、AIDS、多發(fā)性硬化病、蛋白病毒病、退行性病變?nèi)鏏lzheimer及Parkinson氏病以及衰老等過(guò)程中起很重要的作用。 盡管上述病理過(guò)程均與小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)，但小膠質(zhì)細(xì)胞被激活的機(jī)制還不太清楚。綜合本研究和以往文獻(xiàn)資料，P2X7參與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和凋亡效應(yīng)。如果用特異性拮抗劑阻斷ATP的作用，將阻止小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活后所帶來(lái)的對(duì)周圍組織細(xì)胞的損害作用和膠質(zhì)疤痕的形成

5、，從而保護(hù)腦組織不受進(jìn)一步的損害或有利神經(jīng)纖維的再生。 本研究首先使用大鼠P2X7受體基因(GB號(hào)X95882)與EGFP基因融合構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3-hi-EGFP-rP2X7。在此基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染人HEK293細(xì)胞，使用G418作為篩選劑，在0.8mg/ml濃度下，經(jīng)過(guò)單克隆化，建立了穩(wěn)定表達(dá)P2X7受體和EGFP的HEK293細(xì)胞細(xì)胞株，經(jīng)胞外ATP刺激的功能分析和免疫組織化學(xué)等測(cè)試，該細(xì)胞株正確表達(dá)P2X7受

6、體并穩(wěn)定傳代50代以上。 我們使用上海生物芯片公司的人14k基因表達(dá)譜cDNA芯片(SHC-R-HC-100-20)，分析了細(xì)胞外ATP在不同濃度和時(shí)間條件下，通過(guò)活化此轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后所導(dǎo)致的基因表達(dá)變異譜并使用RT-PCR等方法進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為Ratio＞=2或＜=0.5，F(xiàn)lags為P，SN＞2，除去質(zhì)控點(diǎn)、不顯著表達(dá)及無(wú)信號(hào)等數(shù)據(jù)點(diǎn)，在0.05mmol/LATP試驗(yàn)組中，有46個(gè)基因顯著上調(diào)，而顯

7、著下調(diào)的有2個(gè)；0.1mmol/LATP試驗(yàn)組中，有35個(gè)基因顯著上調(diào)，而顯著下調(diào)的有1個(gè)；0.4mmol/LATP試驗(yàn)組中，有51個(gè)基因顯著上調(diào)，而顯著下調(diào)的有13個(gè)；0.8mmol/LATP試驗(yàn)組中，有93個(gè)基因顯著上調(diào)，而顯著下調(diào)的有8個(gè)。就基因顯著表達(dá)的數(shù)量而言，總體上反映了隨著胞外ATP濃度的增高，受P2X7受體介導(dǎo)，基因表達(dá)有活躍的趨勢(shì)。表達(dá)顯著下調(diào)的基因極少，胞外ATP所導(dǎo)致濃度計(jì)量效應(yīng)極為明顯。在挑選出的160個(gè)顯著差異

8、(含上調(diào)與下調(diào))的基因中，基因受ATP濃度影響的趨勢(shì)亦十分明顯。 我們對(duì)其中的16條基因進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證，其中ATF3、BTG2、V-FOS、TGF1、HRK、BCL2、DUSP1、GADD45A、FBJ、STC2、SGK的結(jié)果與芯片的表達(dá)一致。這些基因涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面。其中大部分基因是首次發(fā)現(xiàn)與P2X7的調(diào)節(jié)顯著相關(guān)。 在蛋白質(zhì)組學(xué)方面，通過(guò)使用Ciphergen公司具有疏水反相性質(zhì)

9、的CM10蛋白質(zhì)芯片，結(jié)合SELDI-TOF質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外ATP在不同濃度下，通過(guò)P2X7受體活化的HEK293轉(zhuǎn)染細(xì)胞株所導(dǎo)致的蛋白表達(dá)譜有明星的變異，經(jīng)Biomark軟件分析，0mmol/LATP試驗(yàn)組共有93個(gè)不同質(zhì)荷比的峰值(P＜0.1)；0.1mmol/LATP試驗(yàn)組共有188個(gè)不同質(zhì)荷比的峰值(P＜0.1)；0.8mmol/LATP試驗(yàn)組共有279個(gè)不同質(zhì)荷比的峰值P＜0.1)。從不同濃度試驗(yàn)組的峰值數(shù)量而言，隨著胞外

10、ATP逐漸增高，P2X7受體/HEK293細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量有明顯增多的趨勢(shì)。 0.0mmol/LATP、0.10mmol/LATP和0.80mmol/LATP三個(gè)試驗(yàn)組中，隨著胞外ATP的濃度增高，樣品中M/Z值分別為3551.9、3939.1、4127.3、4282.1、5353.9、6272.3、6541.5的7個(gè)峰值出現(xiàn)明星的上升趨勢(shì)(組間比較，P＜0.02)。而0.0mmol/LATP、0.10mmol/LATP