斑馬魚Cyp19A2基因5′-調(diào)控序列的分析研究和Cyp2J1基因的表達及初步功能研究.pdf

1、斑馬魚中存在兩個細胞色素P450芳香酶基因，即Cypl9A1和Cyp19A2，分別在生殖腺和腦部特異表達，其編碼產(chǎn)物P450芳香酶能夠參與魚體內(nèi)的雌激素合成，催化雄激素轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に兀虼嗽诎唏R魚性激素分泌和性器官發(fā)育過程中都起到非常重要的調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于兩個芳香酶基因的特異表達調(diào)控機制的研究報道極少，僅限于生物信息學(xué)方面的分析。在本論文中，我們克隆了斑馬魚Cypl9A2基因的5'調(diào)控序列，并初步進行了功能分析。通過一系列的內(nèi)部引物，擴

2、增出不同長度的調(diào)控區(qū)域，分別構(gòu)建至報告基因表達載體，包括：pEGFP-aF-aR(-2600～-1bp)、pEGFP-cF-aR(-1700～-1bp)、pEGFP-bF-dR(-2200～-700bp)、pEGFP-cF-dR(-1700～-700bp)、pEGFP-aF-CR(-2600～-1700bp)、pEGFP-aF-bR(-2600～-2200bp)和pEGFP-dF-aR(-700～-1bp)等7個載體，分別顯微注射至斑馬

3、魚1～2細胞期的受精卵，追蹤觀察報告基因的時空表達情況，分析調(diào)控區(qū)的功能。結(jié)果顯示：注射pEGFP-aF-aR的胚胎，當發(fā)育至48hpf，其腦部，包括間腦和中腦部位，以及由腦部向軀干延伸的部分神經(jīng)細胞和表層細胞有EGFP特異表達；注射pEGFP-cF-aR和pEGFP-dF-aR的胚胎，從24hpf開始，EGFP始終集中在卵黃囊表層細胞表達，未出現(xiàn)腦部特異表達；其余4個表達載體的注射胚胎均沒有檢測到EGFP的表達。提示：1)斑馬魚Cyp

4、l9／12基因上游-2600bp調(diào)控序列全長與組織特異表達密切相關(guān)；2)轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1700bp和-700bp是該基因的啟動活性區(qū)域，能驅(qū)動EGFP基因的非特異表達，-700bp是啟動表達所需的最短序列；3)與Cypl9A2基因特異表達相關(guān)的調(diào)控元件極有可能位于-2600～-1700bp區(qū)域內(nèi)。 細胞色素P4502J(Cyp2J)是P450超家族中的一個亞家族，該亞家族目前已發(fā)現(xiàn)有9個基因，即Cyp2J1～CypZl9，其

5、編碼的蛋白酶能夠催化大多數(shù)哺乳動物體內(nèi)的花生四烯酸代謝反應(yīng)，在許多外源及內(nèi)源的固醇類物質(zhì)氧化還原反應(yīng)中起重要作用。然而在斑馬魚中，至今未見有關(guān)于該亞家族基因表達及功能研究的報道。本文中，我們克隆了斑馬魚的CypZll基因，進行了生物信息學(xué)分析，檢測了斑馬魚胚胎及成體組織中CypZll的表達情況，同時進行了CypZll的過表達研究。結(jié)果如下：1)斑馬魚CypZll基因全長1600bp，編碼496個氨基酸的蛋白質(zhì)。BLAST分析表明，斑馬魚

6、的Cyp2J1與小鼠Cyp2J6(NM010008)，人Cyp2J2(NM000775)，BostaurusCypZl2(XP589364)和大鼠Cyp2J4(AAF21133)分別具有51﹪、50﹪、51﹪和50﹪的序列同源性。斑馬魚CypZll含有與人Cyp2J2和小鼠Cyp2J6極其相似的保守結(jié)構(gòu)域，暗示它們可能具有類似的生物催化活性；2)原位雜交結(jié)果顯示zfCyp2J1主要集中在成魚的腦，包括端腦外圍區(qū)、腹面間腦區(qū)和下丘腦區(qū)以及

7、生殖腺，包括卵巢中處于I期和II期發(fā)育階段的卵黃顆粒沉積前卵母細胞和精巢中靠近精小葉邊緣的部分精原細胞中表達，但在斑馬魚早期胚胎中沒有檢測到zfCyp2J1的原位雜交信號；3)半定量RT-PCR結(jié)果顯示zfCyp2J1的mRNA在斑馬魚多種組織中廣泛分布，如大腦和生殖腺，以及心臟、肝臟、。腎臟和肌肉等組織，同時36hpf的斑馬魚胚胎中也能檢測到zfCyp2J1的mRNA；4)斑馬魚Cyp2J1的過表達能嚴重影響胚胎的正常發(fā)育，造成胚胎近