MicroRNAs調(diào)控胸部腫瘤中PLK1、BMI1和DAB2基因的分子機(jī)制及生物學(xué)功能的研究.pdf

1、目的：
　　肺癌和食管癌目前成為胸部腫瘤研究的熱點(diǎn)，在我國(guó)的發(fā)病率一直居高不下，尤其是近年來(lái)肺癌的發(fā)病率增長(zhǎng)速度急劇增加，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占85％以上。食管癌是原發(fā)于食管的惡性腫瘤，主要以食管鱗癌（ESCC）為主。肺癌與食管癌早期癥狀不明顯，絕大多數(shù)患者就診時(shí)已是中晚期，所以缺乏早期的診斷標(biāo)記物是目前肺癌和食管癌高死亡率的主要原因。
　　Polo樣激酶1（Polo-like kinase1，PLK1）是一種細(xì)胞

2、周期調(diào)節(jié)分子，在有絲分裂過(guò)程中起重要作用。BMI1作為多梳基因家族的一種關(guān)鍵癌基因，參與細(xì)胞的自我更新和增殖，對(duì)調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要作用。DAB2蛋白是一種廣泛表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)吞適配器，在多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮主要作用，DAB2在多種癌癥中表達(dá)下降或缺失，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一類(lèi)短鏈非編碼RNAs，通過(guò)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。許多研究表明mi

3、RNAs在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和食管鱗癌（ESCC）中表達(dá)異常并在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。本課題旨在探討胸部腫瘤中PLK1、BMI1和DAB2異常表達(dá)的miRNAs調(diào)控機(jī)制，為胸部腫瘤的早期診斷和治療提供確鑿的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　一．在非小細(xì)胞肺癌中miR-296-5p通過(guò)靶向調(diào)控PLK1抑制細(xì)胞增殖
　　1.運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)及驗(yàn)證具有靶向調(diào)控PLK1的mircoRNAs
　　通過(guò)生物信

4、息學(xué)軟件 TargetScan、PicTar和 mirBase對(duì)直接調(diào)控 PLK1的mircoRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè)。查找 miR-296-5p的成熟體序列并合成 miR-296-5p的模擬體mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后PLK1蛋白表達(dá)變化。預(yù)先將miR-296-5p mimics和含PLK1-3’UTR的雙熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞，運(yùn)用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-296-5p是否與

5、PLK13’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-296-5p通過(guò)靶向調(diào)控PLK1影響NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)功能
　　用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）的方法檢測(cè)臨床病人 NSCLC組織和癌旁組織中PLK1 mRNA和miR-296-5p的相對(duì)表達(dá)量。選取人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE和5株肺癌細(xì)胞（A549、95C、95D、LTEP-α-2和H1299）用Western blot的方法檢測(cè)PLK1的蛋白表達(dá)水平，同

6、時(shí)用 qPCR方法檢測(cè) miR-296-5p的相對(duì)表達(dá)量。用 miR-296-5p mimics和PLK1-siRNA分別轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞，通過(guò)CCK-8和EdU方法檢測(cè)上述基因?qū)SCLC細(xì)胞增殖的影響；
　　二．在非小細(xì)胞肺癌中miR-203通過(guò)靶向調(diào)控BMI1抑制細(xì)胞增殖和侵襲
　　1.運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)及驗(yàn)證具有靶向調(diào)控BMI1的mircoRNAs
　　通過(guò)生物信息學(xué)軟件 TargetScan、PicTa

7、r和 mirBase對(duì)直接調(diào)控 BMI1的mircoRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè)。查找miR-203的成熟體序列并合成miR-203的模擬體mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LTEP-α-2細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后BMI1蛋白表達(dá)變化。運(yùn)用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-203是否與BMI13’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-203通過(guò)靶向調(diào)控BMI1影響NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)功能
　　用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qP

8、CR）的方法檢測(cè)臨床病人NSCLC組織和癌旁組織中BMI1mRNA和miR-203的相對(duì)表達(dá)量。選取人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE和6株肺癌細(xì)胞（A549、H1650、H226、H1299、H460和LTEP-α-2）用Western blot的方法檢測(cè)BMI1的蛋白表達(dá)水平。用 miR-203 mimics和 BMI1-siRNA分別轉(zhuǎn)染 NSCLC細(xì)胞，通過(guò)CCK-8和EdU方法檢測(cè)上述基因?qū)SCLC細(xì)胞增殖的影響。用Transwel

9、l試驗(yàn)檢測(cè)miR-203和BMI1對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲能力的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-203和BMI1對(duì)NSCLC細(xì)胞凋亡的作用。
　　三．在食管鱗癌中miR-93通過(guò)靶向調(diào)控DAB2促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲
　　1.運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)及驗(yàn)證具有靶向調(diào)控DAB2的mircoRNAs
　　通過(guò)生物信息學(xué)軟件TargetScan對(duì)直接調(diào)控DAB2的mircoRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè)。查找miR-93的成熟體序列并合成miR-93的

10、模擬體mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后 DAB2蛋白表達(dá)變化。運(yùn)用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-93是否與DAB2-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2.miR-93通過(guò)靶向調(diào)控DAB2影響ESCC細(xì)胞的生物學(xué)功能
　　用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）的方法檢測(cè)臨床病人 NSCLC組織和癌旁組織中DAB2 mRNA和miR-93的相對(duì)表達(dá)量。用miR-93 mimics和D

11、AB2-siRNA分別轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞，通過(guò)CCK-8和EdU方法檢測(cè)上述基因?qū)SCC細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-93和DAB2對(duì)ESCC細(xì)胞周期的影響。用Transwell試驗(yàn)檢測(cè)miR-93和DAB2對(duì)ESCC細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　四．在食管鱗癌中miR-218通過(guò)靶向調(diào)控BMI1抑制細(xì)胞增殖和遷移
　　1.運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)及驗(yàn)證具有靶向調(diào)控BMI1的mircoRNAs
　　通過(guò)生物信息學(xué)軟件

12、 TargetScan、PicTar和 mirBase對(duì)直接調(diào)控 BMI1的mircoRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè)。查找miR-218的成熟體序列并合成miR-218的模擬體mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后BMI1蛋白表達(dá)變化。運(yùn)用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-218是否與BMI13’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-218通過(guò)靶向調(diào)控BMI1影響ESCC細(xì)胞的生物學(xué)功能
　　

13、用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）的方法檢測(cè)臨床病人 ESCC組織和癌旁組織中miR-218和BMI1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。用正常食管上皮細(xì)胞（HEEC）作為對(duì)照，通過(guò)qPCR試驗(yàn)檢測(cè)miR-218和BMI1 mRNA在ESCC細(xì)胞中的表達(dá)情況。用miR-218 mimics和BMI1-siRNA分別轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞，通過(guò)CCK-8和EdU方法檢測(cè)上述基因?qū)SCC細(xì)胞增殖的影響。用Transwell試驗(yàn)檢測(cè)miR-218和BMI1對(duì)E

14、SCC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-218和BMI1對(duì)ESCC細(xì)胞凋亡的作用。合成過(guò)表達(dá)BMI1（不含3’UTR）質(zhì)粒，構(gòu)建過(guò)表達(dá)BMI1的ESCC細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染miR-218 mimics后，檢測(cè)BMI1蛋白表達(dá)量的變化及對(duì)細(xì)胞表型的影響。
　　結(jié)果：
　　一．在非小細(xì)胞肺癌中miR-296-5p通過(guò)靶向調(diào)控PLK1抑制細(xì)胞增殖
　　1．miR-296-5p靶向結(jié)合PLK1-3’UTR區(qū)域調(diào)控PLK1

15、的蛋白表達(dá)。
　　用miR-296-5p mimics轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞，Western blot顯示PLK1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-296-5p與PLK1-3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)。用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-296-5p與PLK1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-296-5p通過(guò)靶向調(diào)控PLK1影響NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)功能
　　在NSCLC組織中，P

16、LK1的mRNA表達(dá)水平較癌旁組織明顯升高（P<0.01），而miR-296-5p的表達(dá)水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01）。與HBE細(xì)胞株相比PLK1的蛋白表達(dá)量在NSCLC細(xì)胞株中明顯上升，而miR-296-5p的表達(dá)量在NSCLC細(xì)胞株中均下降。用miR-296-5p mimics和PLK1-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞株，通過(guò)CCK-8和EdU方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-296-5p和下調(diào)PLK1表達(dá)均能抑制N

17、SCLC細(xì)胞的增殖。
　　二．在非小細(xì)胞肺癌中miR-203通過(guò)靶向調(diào)控BMI1抑制細(xì)胞增殖和侵襲
　　1．miR-203靶向結(jié)合BMI1-3’UTR區(qū)域調(diào)控BMI1的蛋白表達(dá)。
　　用miR-203 mimics轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞，Western blot顯示BMI1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-203與BMI1-3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)。用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-203與BMI

18、1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-203通過(guò)靶向調(diào)控BMI1影響NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)功能
　　在NSCLC組織中 BMI1mRNA表達(dá)水平較癌旁組織明顯上升（P<0.01），而miR-203的表達(dá)水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01）。與HBE細(xì)胞株相比BMI1的蛋白表達(dá)量在NSCLC細(xì)胞株中明顯上升。用miR-203 mimics和BMI1-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞株，CCK-8和EdU方

19、法檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-203和下調(diào)BMI1表達(dá)均能抑制NSCLC細(xì)胞增殖。用miR-203 mimics和BMI1-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞株，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示過(guò)表達(dá)miR-203或下調(diào)BMI1的表達(dá)均能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。用miR-203 mimics和BMI1-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞株，侵襲實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)miR-203或下調(diào)BMI1表達(dá)均能抑制細(xì)胞侵襲能力。
　　三．在食管鱗癌中miR-93通過(guò)靶

20、向調(diào)控DAB2促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲
　　1. miR-93靶向結(jié)合DAB2-3’UTR區(qū)域調(diào)控DAB2的蛋白表達(dá)。
　　用miR-93 mimics轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞，Western blot顯示DAB2蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-93與DAB2-3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)。用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-93與DAB2-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-93通過(guò)靶向調(diào)控

21、DAB2影響ESCC細(xì)胞的生物學(xué)功能
　　在ESCC組織中 DAB2 mRNA表達(dá)水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01），而miR-93的表達(dá)水平較癌旁組織明顯上升（P<0.05）。用miR-93 mimics和DAB2-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞株，CCK-8和EdU方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-93和下調(diào)DAB2表達(dá)均能促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖。用miR-93 mimics和DAB2-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞

22、株，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示過(guò)表達(dá)miR-93或下調(diào)DAB2的表達(dá)均能促進(jìn)細(xì)胞周期。用miR-93 mimics和DAB2-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞株，侵襲實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)miR-93或下調(diào)DAB2表達(dá)均能促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力。
　　四．在食管鱗癌中miR-218通過(guò)靶向調(diào)控BMI1抑制細(xì)胞增殖和遷移
　　1．miR-218靶向結(jié)合BMI1-3’UTR區(qū)域調(diào)控BMI1的蛋白表達(dá)
　　用miR-218 mimics轉(zhuǎn)染ESCC

23、細(xì)胞，Western blot顯示BMI1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-218與BMI1-3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)。用雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218與BMI1-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2. miR-218通過(guò)靶向調(diào)控BMI1影響ESCC細(xì)胞的生物學(xué)功能
　　在ESCC組織中 miR-218表達(dá)水平較癌旁組織明顯下降（P<0.01），而B(niǎo)MI1 mRNA的表達(dá)水平較癌旁組織

24、明顯上升（P<0.01）。與HEEC細(xì)胞株相比miR-218表達(dá)量在ESCC細(xì)胞株中明顯下降。用miR-218mimics和BMI1-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞株，CCK-8和EdU方法檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-218和下調(diào)BMI1表達(dá)均能抑制ESCC細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示過(guò)表達(dá)miR-218或下調(diào)BMI1的表達(dá)均能促進(jìn)細(xì)胞凋亡；侵襲實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)miR-218或下調(diào)BMI1的表達(dá)均能抑制細(xì)胞的侵襲能力。用miR-218 m

25、imics轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)PLK1但不含3’UTR質(zhì)粒的ESCC細(xì)胞株，Western blot顯示miR-218下調(diào)BMI1的蛋白表達(dá)，但這種下調(diào)結(jié)果可被轉(zhuǎn)染PLK1質(zhì)?；謴?fù)。同時(shí)miR-218誘導(dǎo)的抑制ESCC的細(xì)胞增殖、細(xì)胞劃痕和細(xì)胞侵襲的效果可被過(guò)表達(dá)PLK1的質(zhì)?；謴?fù)。
　　結(jié)論：
　　1. miR-296-5p通過(guò)靶向結(jié)合PLK1抑制NSCLC細(xì)胞的增殖。
　　2. miR-203通過(guò)靶向結(jié)合BMI1抑制NSCL