人ELAC2基因在腫瘤中的生物學(xué)功能研究.pdf

1、目的：
　　 研究ELAC2基因?qū)θ橄侔┖颓傲邢侔┥L(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移和放射敏感性的影響，及其可能的作用機(jī)制，同時(shí)研究ELAC2與雄激素受體相互作用及其對(duì)雄激素受體轉(zhuǎn)錄活性的影響，為該基因在將來(lái)的臨床治療中提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將ELAC2基因轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，挑取陽(yáng)性克隆。用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)ELAC2基因的mRNA表

2、達(dá)和蛋白表達(dá)，并對(duì)細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定。
　　 2、將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ELAC2基因的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白組。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性；流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡；細(xì)胞劃痕法觀察細(xì)胞體外遷移能力；Boyden小室法檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力；Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　 3、皮下分別注射實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空

3、白組腫瘤細(xì)胞，建立BALB/c裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，觀察體內(nèi)ELAC2對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的影響；用免疫組化方法檢測(cè)各組腫瘤微血管生成情況。尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型，觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。
　　 4、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組細(xì)胞受X射線照射后，采用集落形成法檢測(cè)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡；Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　

4、5、采用GST-pull down和免疫共沉淀的方法分析ELAC2蛋白與雄激素受體(AR)蛋白、HDAC1蛋白的相互作用；采用體外雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)反應(yīng)體系分析ELAC2對(duì)AR轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、pcDNA3-ELAC2質(zhì)粒構(gòu)建成功并順利轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中，檢測(cè)到ELAC2基因的mRNA水平和蛋白水平高表達(dá)，且遺傳性狀穩(wěn)定。
　　 2、轉(zhuǎn)染ELAC2基因的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-

5、231、MCF-7以及前列腺癌細(xì)胞Du-145增殖能力明顯低于對(duì)照組細(xì)胞和空白組細(xì)胞；轉(zhuǎn)基因組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例升高，cyclinB表達(dá)降低，磷酸化CDC2(Tyr-15)表達(dá)升高。
　　 3、ELAC2基因高表達(dá)未觀察到引起乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7凋亡發(fā)生，但可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞Du-145凋亡，轉(zhuǎn)基因組細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高。
　　 4、與對(duì)照組和空白組細(xì)胞比較

6、，ELAC2高表達(dá)明顯降低乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7以及前列腺癌細(xì)胞Du-145的體外侵襲轉(zhuǎn)移能力。Western blot法結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染ELAC2基因的細(xì)胞，NF-kB、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平降低。
　　 5、ELAC2基因高表達(dá)可明顯抑制乳腺癌腫瘤和前列腺癌腫瘤生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染基因的實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均瘤重和平均瘤體積明顯低于對(duì)照組和空白組。免疫組化結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤微血管數(shù)目顯著低于對(duì)照組和空白組。

7、>　　 6、尾靜脈注射腫瘤轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示：ELAC2高表達(dá)可抑制乳腺癌肝轉(zhuǎn)移，空白組和對(duì)照組裸鼠肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率為83％，而轉(zhuǎn)染ELAC2基因的實(shí)驗(yàn)組所有裸鼠未出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。
　　 7、細(xì)胞受照后，與對(duì)照組和空白組細(xì)胞比較，ELAC2高表達(dá)使乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7以及前列腺癌細(xì)胞Du-145放射敏感性增加；G2/M期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例下降；cyclinB降低和磷酸化CDC2升高，損傷修復(fù)蛋白Ku-70、

8、FEN-1表達(dá)水平下降。
　　 8、采用GST-pull down和免疫共沉淀的方法證明，ELAC2可以與HDAC1相結(jié)合，同時(shí)輻射可以導(dǎo)致ELAC2和HDAC1結(jié)合增加。野生型的ELAC2蛋白可以與雄激素受體(AR)蛋白直接結(jié)合。這種相互結(jié)合并不需要ELAC2蛋白序列中的兩個(gè)NR協(xié)同刺激因子通有的LXXLL結(jié)構(gòu)域(4LCSLL8和254LPSIL258)，而需要兩個(gè)NR協(xié)同抑制因子通有的LXXX(I/L)XXX(I/L)結(jié)構(gòu)域

9、(268LGKPLHPLL276和294LGKPLHPLL302)的存在。
　　 9、采用體外雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)反應(yīng)體系分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染ELAC2，能明顯降低雄激素配體-受體(DHT-AR)作用下的ARE-LUC報(bào)告基因活性。而且提高HDAC1的表達(dá)可以進(jìn)一步增強(qiáng)ELAC2對(duì)AR轉(zhuǎn)錄活性的抑制效應(yīng)。而HDAC1的特異抑制劑TSA則降低ELAC2對(duì)AR的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、ELAC2基因能在

10、轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定、持續(xù)、高效地表達(dá)。
　　 2、ELAC2高表達(dá)能明顯抑制乳腺癌以及前列腺癌的生長(zhǎng)，其可能的機(jī)制與細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成有關(guān)。
　　 3、ELAC2高表達(dá)可抑制乳腺癌和前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，其可能的機(jī)制與下調(diào)NF-kB、MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)。
　　 4、ELAC2高表達(dá)可通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控，促進(jìn)凋亡，降低細(xì)胞損傷修復(fù)能力，增加乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞