半月板基質(zhì)及松質(zhì)骨源性的復合半月板支架修復兔內(nèi)側(cè)半月板缺損的實驗研究.pdf

1、實驗目的:半月板損傷后難以自行修復，如何實現(xiàn)半月板的再生是醫(yī)學界面臨的巨大挑戰(zhàn)，本課題的研究目的:1.利用脫細胞半月板基質(zhì)及脫礦松質(zhì)骨成功構(gòu)建脫細胞半月板基質(zhì)支架、脫礦松質(zhì)骨支架及脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨支架等三種組織工程半月板支架，并比較其理化學特性及動物體內(nèi)免疫排斥反應;2.利用兔半月板纖維軟骨細胞(Meniscal Fibrochondrocytes，MFC)觀察三種支架的細胞毒性，細胞相容性及對纖維軟骨細胞袁型的影響;3.分

2、別將三種支架原位植入兔內(nèi)側(cè)半月板缺失模型中，觀察其促進半月板再生情況以及對膝關(guān)節(jié)軟骨保護情況。
　　實驗方法:1.通過物理化學方法制備脫細胞半月板基質(zhì)水凝膠，利用改良Urist法制備脫礦松質(zhì)骨，最后利用真空灌注，模具塑形及冷凍干燥的方法制備三種不同的半月板支架;2.三種支架的理化學特性檢測:利用掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，利用組織學及生物化學方法檢測其組成成分，利用BOSE生物力學機檢測其拉伸及壓縮彈性模量;3.分別將三種支架植入SD

3、大鼠皮下觀察其免疫排斥反應;4.將兔半月板纖維軟骨細胞分別種植到三種支架上，利用掃描電鏡觀察其細胞生長微觀結(jié)構(gòu)，利用死活染色觀察三種支架的細胞毒性，利用DNA、GAG及膠原定量分析生長在三種不同支架上的纖維軟骨細胞在3、7、14天時細胞增殖及分泌GAG和膠原情況;5.將三種支架原位植入兔內(nèi)側(cè)半月板缺失模型中，并分別于3月、6月時處死取材，利用大體觀、組織學、X-RAY、MRI、生物力學測試及RT-PCR檢測觀察半月板再生情況及對膝關(guān)節(jié)關(guān)

4、節(jié)軟骨保護情況。
　　實驗結(jié)果:1.掃描電鏡結(jié)果顯示三種支架均具有良好的孔隙率及三維孔隙結(jié)構(gòu);脫細胞半月板基質(zhì)支架及脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨支架比脫礦松質(zhì)骨支架具有更高的GAG含量(P＜0.05);脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨支架與脫細胞半月板基質(zhì)支架及脫礦松質(zhì)骨支架相比具有更好的生物力學特性(P＜0.05);三種支架種植于大鼠皮下均未見明顯的免疫排斥反應;2.兔半月板纖維軟骨細胞均可在三種支架上生長，死活染色結(jié)果顯示其細胞存

5、活率差異無統(tǒng)計學差異;其細胞增殖及分泌GAG和膠原結(jié)果顯示:在7天和14天時種植于脫細胞半月板基質(zhì)支架和脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨支架上的纖維軟骨細胞其細胞增殖及分泌GAG和膠原能力均比種植于脫礦松質(zhì)骨支架上的高(P＜0.05)。3.兔體內(nèi)原位植入結(jié)果顯示，空白缺損組及脫細胞半月板基質(zhì)組均未見明顯的新生半月板組織，僅有少量滑膜再生，脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨支架組及脫礦松質(zhì)骨組可見明顯的新生半月板組織，新生半月板組織學Ishida評

6、分顯示脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨支架組明顯優(yōu)于脫礦松質(zhì)骨組(P＜0.05)，相對應的股骨髁及脛骨平臺軟骨Mankin評分結(jié)果顯示脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨支架組也明顯優(yōu)于其余三組(P＜0.05)，X線K-L分級評分及核磁共振WORMS評分也均顯示脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨支架組優(yōu)于其余三組(P＜0.05)，新生半月板拉伸力學測試結(jié)果顯示隨著植入時間的延長其拉伸力學性能增強，并且在同一時間點脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨組要優(yōu)于脫礦松

7、質(zhì)骨組(P＜0.05)，同時新生半月板mRNA表達結(jié)果顯示，隨著植入時間的延長其Aggrecan、Sox9和CollagenⅡ表達均上升(P＜0.05)，并且脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨支架組的表達量高于脫礦松質(zhì)骨組(P＜0.05)。
　　實驗結(jié)論:脫細胞半月板基質(zhì)/脫礦松質(zhì)骨半月板支架具有良好的三維孔隙結(jié)構(gòu)，相對于單純脫礦松質(zhì)骨支架和脫細胞半月板基質(zhì)支架相比具有更好的生物力學特性，并且可以促進兔半月板纖維軟骨細胞增殖及分泌GAG