MicroRNA-126對(duì)INS-1細(xì)胞功能的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病。其基本病理特點(diǎn)為胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，或外周組織對(duì)胰島素不敏感，以糖代謝紊亂為主，包括脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂的一種全身性疾病。糖尿病的患病率在全球逐年增長(zhǎng)。據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO估計(jì),至2030年,全球糖尿病患病人數(shù)將達(dá)3億。據(jù)估計(jì)，中國(guó)現(xiàn)有成人糖尿病患者9240萬(wàn)，已成為世界糖尿病人數(shù)最多的國(guó)家。在糖尿病患者中90％以上是Ⅱ型糖尿病，

2、嚴(yán)重影響人們的健康。糖尿病發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，而胰島素抵抗在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色，但胰島素抵抗的機(jī)制尚不明確。
　　胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素，由體內(nèi)胰島β細(xì)胞分泌，體內(nèi)唯一降血糖激素。胰島素信號(hào)通路涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，其中鈣離子濃度的變化對(duì)胰島素的分泌有重要影響。有文獻(xiàn)報(bào)道，在胰島素信號(hào)通路中存在著microRNA(miRNA,miR)-126的作用靶點(diǎn)，且本實(shí)驗(yàn)室前期工作證實(shí)胰島素受體底物1（IRS-1）也是其作用靶點(diǎn)。但

3、是miR-126是否影響胰島β細(xì)胞合成和釋放胰島素尚不明確。本課題利用胰島瘤B細(xì)胞（INS-1）模型，研究miR-126對(duì)INS-1細(xì)胞電壓敏感鈣通道電流、鈣離子濃度及胰島素分泌量的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.鋪種INS-1細(xì)胞，24h后轉(zhuǎn)染40nM的不同miRNA,轉(zhuǎn)染時(shí)間為48h，人工合成胰島素100nM刺激細(xì)胞12h。熒光定量PCR檢測(cè)INS-1細(xì)胞中miR-126基因的表達(dá)水平。
　　2.激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)

4、INS-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，分組：①陰性對(duì)照組（NC）組，轉(zhuǎn)染nonsense strand；②miR-126過(guò)表達(dá)（miR-126m）組，轉(zhuǎn)染miR-126 mimic；③miR-126低表達(dá)（miR-126i）組，轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor；④陽(yáng)性對(duì)照（miR-375m）組，轉(zhuǎn)染miR-375 mimic。
　　3.穿孔膜片鉗技術(shù)檢測(cè)INS-1細(xì)胞膜上電壓敏感鈣通道電流，分組：陰性對(duì)照（NC）組和miR-126

5、m組。
　　4. Elisa實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀，分別檢測(cè)INS-1細(xì)胞胰島素分泌量及線粒體膜電位變化，分組：陰性對(duì)照（NC）組，miR-126m組，miR-126i組，陽(yáng)性對(duì)照（miR-375m）組。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.熒光定量PCR結(jié)果顯示：與NC組基因miR-126（107.26±37.88，n=4）的表達(dá)量相比，miR-126m組（398.77±53.72，n=4）的基因表達(dá)量顯著升高（P<0.01）；而mi

6、R-126i組（20.26±7.827，n=4）的基因表達(dá)量較NC組的明顯下降（P<0.05）。
　　2.激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)INS-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，結(jié)果顯示：基礎(chǔ)葡萄糖（5.6mM葡萄糖）刺激細(xì)胞，miR-126m組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度較NC組明顯升高（P<0.05），miR-126i組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度較NC組顯著降低（P<0.05）；高濃度葡萄糖（16.8mM葡萄糖）刺激細(xì)胞，miR-126m組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和NC組無(wú)顯著差異

7、（P>0.05）；miR-126i組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度較NC組顯著降低（P<0.05）。穿孔膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜電壓敏感鈣通道電流，結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-126m組細(xì)胞鈣離子內(nèi)流增加（P<0.05）。
　　3. Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰島素分泌量，結(jié)果顯示：基礎(chǔ)胰島素分泌量miR-126m組較NC組分泌量增加（P<0.05）；miR-126i組胰島素分泌量較NC組顯著降低（P<0.05）；高濃度葡萄糖刺激細(xì)胞，其胰島素分泌量：

8、miR-126m組胰島素分泌量和NC組無(wú)顯著差異（P>0.05）；miR-126i組胰島素分泌量較NC組顯著降低（P<0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位，結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-126m組和miR-375m組細(xì)胞凋亡增加（P<0.05），miR-126i組細(xì)胞凋亡降低（P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1.過(guò)表達(dá)miR-126可以增加INS-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，并且使鈣離子內(nèi)流增加；
　　2.過(guò)表達(dá)mi