副溶血弧菌T3SS2新效應(yīng)蛋白的鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、副溶血弧菌是一種全球性傳播的病原菌，感染時(shí)能引發(fā)急性腸胃炎、傷口感染，甚至誘發(fā)敗血癥。研究顯示該菌毒力因子包括溶血毒素、粘附素、Ⅲ型及Ⅵ型分泌系統(tǒng)等，其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)及其分泌的效應(yīng)蛋白與其致病性密切相關(guān)。由染色體1編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SS1分泌的效應(yīng)蛋白主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、變圓和裂解這一系列過(guò)程來(lái)發(fā)揮細(xì)胞毒性作用；染色體2編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SS2分泌的效應(yīng)蛋白主要通過(guò)破壞細(xì)胞骨架和操控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等發(fā)揮腸毒性作用。目前針對(duì)Ⅲ型分

2、泌系統(tǒng)T3SS2的研究引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，由于T3SS2有80個(gè)相關(guān)基因編碼在VP-PAI毒力島上，其中僅少數(shù)幾個(gè)蛋白得到研究，因此本實(shí)驗(yàn)從中選出幾個(gè)新型的效應(yīng)蛋白進(jìn)行研究。
　　首先利用生物信息學(xué)技術(shù)從T3SS2相關(guān)VP-PAI上篩選出VPA1324和VPA1360兩種基因，通過(guò)構(gòu)建兩種基因的重組表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化蛋白，然后免疫小鼠獲得相應(yīng)抗血清。通過(guò)Western blot和RT-PCR兩種方法驗(yàn)證在膽鹽作用下VP

3、A1324和VPA1360基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，結(jié)果顯示VPA1324和VPA1360蛋白是T3SS2相關(guān)的分泌蛋白。其中VPA1324經(jīng)生物信息學(xué)分析可能為二鳥苷酸磷酸二酯酶。為此，以c-di-GMP為底物，利用高效液相色譜法檢測(cè)VPA1324蛋白酶活性，結(jié)果表明VPA1324可降解c-di-GMP，具有磷酸二酯酶活性。構(gòu)建該基因的重組質(zhì)粒pEGFP-VPA1324-C1并轉(zhuǎn)染至Hela和Caco-2細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)VPA1324的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)