骨髓基質(zhì)細胞來源的神經(jīng)干細胞球在纖維蛋白原支架上向經(jīng)驗之談細胞及膠質(zhì)細胞分化的研究.pdf

1、目的：建立骨髓間質(zhì)干細胞來源的神經(jīng)干細胞球的體外培養(yǎng)方法,動態(tài)觀察神經(jīng)干細胞球向神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化過程,探討骨髓間質(zhì)干細胞向神經(jīng)組織細胞的分化機制及在普通支架及纖維蛋白支架上向神經(jīng)細胞及膠質(zhì)細胞的分化,為骨髓間質(zhì)干細胞作為種子細胞構(gòu)建組織工程支架,移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：⑴分離、培養(yǎng)人骨髓間質(zhì)干細胞,普通貼壁培養(yǎng)到第三代通過免疫熒光染色,觀察所培養(yǎng)得到的細胞是否具有Viment

2、in、CD29、CD44、CD105骨髓間質(zhì)干細胞的特征性標(biāo)志。⑵抗貼壁培養(yǎng)第三代的骨髓間質(zhì)干細胞,同時加用含有2％B27、EGF(40ng／ml)、bFGF(20ng／ml)的DMEM／F12神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)成神經(jīng)干細胞,通過免疫印跡法檢測Nestin、CD133、NCAM、SHH,比較抗貼壁培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)的細胞的表達的差異。⑶抗貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞種植于涂有FN+LN的玻璃蓋片的硬質(zhì)表面與制備有纖維蛋白支架的軟質(zhì)表面,用含有2％

3、B27添加劑、1％FBS、50ng／ml SHH、1ug／ml RA、50ng／ml NGF的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)14天,用通過免疫熒光染色技術(shù)及免疫印跡法測定NF200、β—TubulinⅢ、MBP、cnpase、GFAP等標(biāo)志蛋白,比較骨髓間質(zhì)干細胞來源的神經(jīng)干細胞在兩種不同硬度的表面向神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化。
　　 結(jié)果：①分離人骨髓單個核細胞進行普通貼壁培養(yǎng)所得的骨髓間質(zhì)干細胞具有間質(zhì)干細胞的形態(tài)學(xué)特征,

4、且均表達干細胞標(biāo)記Vimentin,CD29,CD44,CD105。②通過抗貼壁培養(yǎng),骨髓間質(zhì)干細胞加用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后轉(zhuǎn)化為能形成細胞球的神經(jīng)干細胞,免疫熒光染色及免疫印跡對Nestin、CD133、NCAM、SHH的表達檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),普通貼壁培養(yǎng)較抗貼壁培養(yǎng)的細胞Nestin、CD133、NCAM、SHH的表達弱。③人骨髓間質(zhì)干細胞來源的神經(jīng)干細胞球涂布在有FN+LN的圓蓋片、纖維蛋白支架上,用神經(jīng)細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)14天

5、后,免疫熒光染色與免疫印跡測定均顯示在纖維蛋白支架組神經(jīng)干細胞球NF200、β—TubulinⅢ、MBP、cnpase表達強陽性,而FN+LN的圓蓋片組表達減弱,GFAP表達則纖維蛋白組弱,FN+LN的圓蓋片組表達強。
　　 結(jié)論：⑴采用密度梯度離心分離法分離骨髓單個核細胞,通過換液傳代進一步純化得到的細胞具有BMMSCs特性,可以用于向神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化。⑵比較貼壁和抗貼壁成球培養(yǎng)誘導(dǎo)分化人骨髓間質(zhì)干細胞,表明抗貼壁培養(yǎng)有助于