結(jié)核分枝桿菌新人T細(xì)胞表位及特異性蛋白的抗原性研究.pdf

1、結(jié)核病（tuberculosis，TB）是一種由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引發(fā)的嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病。近些年來，由于耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）和廣泛耐藥結(jié)核病（XDR-TB）的流行及MTB與人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）共同感染等原因，古老的結(jié)核病再次成為全球面臨的嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。然而，目前診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)依

2、然是羅氏固體培養(yǎng)，尚無有效、快速診斷結(jié)核病的方法。同時(shí)，研究已證實(shí)BCG的保護(hù)效果不理想，特別是對成年人結(jié)核幾乎無預(yù)防效果。結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白及其抗原表位的研究，在開發(fā)結(jié)核病新型診斷方法和研究有效的結(jié)核病新疫苗中具有著重要的作用。
　　本研究采用兩種方法開展了結(jié)核分枝桿菌特異性抗原及人 T細(xì)胞表位的研究，以期發(fā)現(xiàn)最佳的新T細(xì)胞抗原，為后續(xù)診斷試劑和疫苗研究提供基礎(chǔ)。一方面采用生物信息學(xué)方法，排除PE/PPE家族蛋白、轉(zhuǎn)座子及已

3、知抗原表位，對余下的所有蛋白進(jìn)行系統(tǒng)、全面的人T細(xì)胞表位預(yù)測，并從中篩選優(yōu)勢表位進(jìn)行生物合成。合成的表位，采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)斑點(diǎn)法（ELISPOT）進(jìn)行初步及擴(kuò)大樣本量兩步驗(yàn)證。同時(shí)對表位集中的預(yù)測抗原及已知表位信息的特異性抗原，根據(jù)其編碼基因序列設(shè)計(jì)引物，分子克隆方法獲得重組質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化入原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)Ni親和柱親和層析方法純化，得到各重組蛋白。若重組蛋白為包涵體表達(dá)形式，采用透析復(fù)性以恢復(fù)天然構(gòu)象。最后，建立最佳血清及抗原濃

4、度的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法，初步評價(jià)重組蛋白的抗原性。
　　利用TEPredict和IEDB兩個(gè)軟件同時(shí)預(yù)測出了273個(gè)抗原蛋白的2726個(gè)表位，從中篩選出評分大于5的50個(gè)表位，主要分布于Rv1798、Rv0197、Rv0658c、Rv2942及Rv3239c5個(gè)抗原。經(jīng)進(jìn)一步表位優(yōu)化，獲取分布于5個(gè)抗原上的32條多肽，由生物公司合成并純化。采集結(jié)核病人血，分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），ELISPOT方法進(jìn)行

5、初步篩選。經(jīng)10個(gè)細(xì)菌學(xué)陽性病人血樣本對每條多肽的篩選，獲得6條陽性多肽。對于陽性肽再使用50個(gè)細(xì)菌學(xué)陽性的結(jié)核病人及60個(gè)肺部病人和60個(gè)健康人作為對照進(jìn)行驗(yàn)證。單條肽Rv1798-1、Rv1798-2、Rv0197、Rv0658c、Rv2942、Rv3239c的靈敏度分別為12.0％、18.0%、20.0%、8.0%、10.0%、4.0%，特異度均在99%以上。抗原Rv1798兩條多肽聯(lián)合靈敏度為24.0%，而特異度達(dá)到100%。由

6、此可見，多肽聯(lián)合用于結(jié)核病的診斷價(jià)值，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單條多肽。
　　同時(shí)，我們選擇了10個(gè)特異性蛋白抗原進(jìn)行分子克隆及原核表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了相應(yīng)抗原的重組質(zhì)粒，表達(dá)純化得到GroES、LpqH、PstS3、PPE18、PPE19、GlnA1、PlcA和EccA58種重組蛋白（其中兩個(gè)重組質(zhì)粒未表達(dá)成功）。進(jìn)一步采用ELISA方法評價(jià)了這些蛋白在血清學(xué)中的診斷價(jià)值。抗原GroES、PPE18、PPE19、GlnA1及EccA5的診斷價(jià)

7、值較高，曲線下面積（AUC）大于80%，其中靈敏度分別為72.1%、76.8%、59.0%、66.8%、66.8%，特異度分別為81.4%、78.4%、92.2%、78.4%、83.3%?？乖璍pqH、PstS3和PlcA的AUC也均大于70%，其靈敏度分別為66.3%、52.1%、75.3%，特異度分別為68.6%、88.2%、65.7%。
　　綜上所述，本研究首次采用TEPredict和IEDB兩個(gè)軟件同時(shí)對結(jié)核分枝桿菌毒力相