17β-雌二醇抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　初步探究雌激素保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞凋亡的作用。
　　方法：
　　這項(xiàng)研究的目的是以離體實(shí)驗(yàn)探討雌激素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。為了提取大鼠原代髓核細(xì)胞，采用了胰酶消化的方法。為了使培養(yǎng)后貼壁的大鼠髓核細(xì)胞有助于傳代，采用了含有0.2％EDTA的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，使其成為細(xì)胞懸浮液，傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞第3代時(shí)，重復(fù)傳代步驟，為了減少細(xì)胞干預(yù)影響，確定實(shí)驗(yàn)分組后培養(yǎng)細(xì)胞，采用的細(xì)胞培養(yǎng)

2、液中沒有加入胎牛血清和酚紅的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，該實(shí)驗(yàn)按時(shí)間先后順序分為三個(gè)階段，第一階段實(shí)驗(yàn)分組為，每組為5個(gè)樣本。對(duì)照組：以不含雙氧水及雌激素的培養(yǎng)液處理；1μm/l組：加入濃度為1μm/l的雙氧水干預(yù)；10μm/l組：加入濃度為10μm/l的雙氧水干預(yù)，100μm/l組：加入濃度為100μm/l的雙氧水干預(yù)，500μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水干預(yù)，1000μm/l組：加入濃度為1000μm/l的雙氧水干預(yù)，

3、第二階段按照作用時(shí)間來分組實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組：以不含雙氧水及雌激素的培養(yǎng)液處理；1小時(shí)組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用1小時(shí)，3小時(shí)組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用3小時(shí)，6小時(shí)組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用6小時(shí)，12小時(shí)組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用12小時(shí)，24小時(shí)組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用24小時(shí)，第三階段按照17β-雌二醇的濃度來分組實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組：以不含雙氧水、雌激素及其抑制劑的培養(yǎng)

4、液處理；凋亡組：加入濃度為500μm/l的雙氧水作用6小時(shí)，0.1μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水及0.1μm/l的17β-estradiol作用6小時(shí)，1μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水及1μm/l的17β-estradiol作用6小時(shí)，5μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水及5μm/l的17β-estradiol作用6小時(shí)，10μm/l組：加入濃度為500μm/l的雙氧水及10μm/l的17β-est

5、radiol作用6小時(shí)，抑制劑組：加入濃度為500μm/l的雙氧水和10μm/l的17β-estradiol及10μm/l的雌激素抑制劑作用6小時(shí)，應(yīng)用：1大鼠的髓核細(xì)胞及染色后細(xì)胞核的形態(tài)是用倒置相差顯微鏡及熒光染色來觀察；2乳酸脫氫酶毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶釋放量；3運(yùn)用CCK-8方法測(cè)定細(xì)胞增殖活力；4實(shí)驗(yàn)中大鼠髓核細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)，是應(yīng)用了流式細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)的方法；5凋亡蛋白caspase-3在各個(gè)實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞中的表達(dá)含量的檢測(cè)

6、是采用了western蛋白印跡法；6用實(shí)時(shí)定量PCR的法來檢測(cè)纖維環(huán)細(xì)胞中的caspase-3蛋白相關(guān)基因表達(dá)情況。第一階段，大鼠的髓核細(xì)胞分別以濃度為（0,1,10,100,500和1000μm/l）的雙氧水處理，研究雙氧水其細(xì)胞毒性作用的劑量依賴性，第二階段，以濃度為500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞（1，3，6，12和24小時(shí)），研究雙氧水其細(xì)胞毒性作用的時(shí)間依賴性，第三階段，以濃度為（0,0.1,1,5,10μm/l）的17

7、β-雌二醇處理大鼠髓核細(xì)胞研究17β-雌二醇其細(xì)胞保護(hù)作用的劑量依賴性。
　　結(jié)果：
　　1原代大鼠的髓核細(xì)胞在相差倒置顯微鏡下觀察大部分呈現(xiàn)出多角形與長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核熒光染色后在顯微鏡下觀察以圓形以及橢圓形居多，并且可以在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到分泌顆粒，大鼠髓核細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底部貼壁需要大概24到48 h，隨后進(jìn)入其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再培養(yǎng)7~8 d細(xì)胞即可,細(xì)胞可傳至6～8代培養(yǎng)。細(xì)胞皺縮、空泡形成等凋亡形態(tài)可在雙氧水作用過后的

8、細(xì)胞中觀察到，細(xì)胞核呈現(xiàn)出皺縮及裂解的形態(tài)。
　　2乳酸脫氫酶毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶釋放量結(jié)果顯示，在濃度依次為1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l雙氧水的條件下，乳酸脫氫酶的釋放量分別為對(duì)照組的2.3倍、3.4倍、4.7倍、6.2倍、6.4倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即雙氧水引起大鼠髓核細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放量提高具有時(shí)間依賴性，此外與對(duì)照組相比較在500μm/l雙氧水條件下細(xì)胞經(jīng)過1小時(shí)、3

9、小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放量分別提高到2.6倍、4.5倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即雙氧水引起大鼠髓核細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放量升高具有時(shí)間依賴性。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞6小時(shí)后，以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-雌二醇處理細(xì)胞，與對(duì)照組相比其乳酸脫氫酶的釋放量分別為4.9倍、3.4倍、2.2倍、1.3倍。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即17β-雌二醇抗

10、雙氧水引起大鼠髓核細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶釋放量降低具有劑量依賴性。
　　3運(yùn)用CCK-8方法測(cè)定細(xì)胞增殖活力結(jié)果為在濃度依次為1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l雙氧水的條件下，細(xì)胞活性分別為對(duì)照組的82.17%±0.15%、67.57%±0.23%、48.63%±0.31%、27.53%±0.17%、25.87%±0.25%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即雙氧水引起大鼠髓核細(xì)胞活性降低具有劑量依賴性，此外

11、與對(duì)照組相比較在500μm/l雙氧水條件下細(xì)胞經(jīng)過1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后細(xì)胞活性分別為對(duì)照組的78.23%±0.09%、46.87%±0.63%、23.56%±0.32%、22.63%±0.22%、21.52%±0.33%。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即雙氧水引起大鼠髓核細(xì)胞活性降低具有時(shí)間依賴性。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞6小時(shí)后，以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-estrad

12、iol處理細(xì)胞，與對(duì)照組相比其細(xì)胞活性分別為32.43%±0.21%、42.37%±0.22%、63.82%±0.35%、86.87%±0.25%。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即17β-雌二醇抗雙氧水引起大鼠髓核細(xì)胞活性降低具有劑量依賴性。
　　4大鼠髓核細(xì)胞在不同濃度的雙氧水處理下的細(xì)胞凋亡率以流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)來觀察，結(jié)果顯示，雙氧水在濃度為0μm/l時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的凋亡率為0.71%±0.32%，雙氧水在濃度為1μm/l時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的

13、凋亡率為4.66%±0.33%，雙氧水在濃度為10μm/l時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的凋亡率為8.87%±0.19%，雙氧水在濃度為100μm/l時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的凋亡率為19.62%±0.29%，雙氧水在濃度為500μm/l時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的凋亡率為31.72%±0.31%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的凋亡率逐漸升高與雙氧水濃度的上升密切相關(guān)。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞1小時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的凋亡率為8.87%±0.25%，以50

14、0μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞3小時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的凋亡率為17.97%±0.28%，以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞6小時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的凋亡率為23.98%±0.35%，以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞12小時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的凋亡率為29.35%±0.34%，以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞24小時(shí)大鼠髓核細(xì)胞的凋亡率為35.20%±0.37%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即雙氧水引起大鼠髓核細(xì)胞的凋亡具有時(shí)間依賴性。

15、以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞6小時(shí)后，以0.1μm/l的17β-雌二醇處理，凋亡率為21.34%±0.35%，以1μm/l的17β-雌二醇處理，凋亡率為14.90%±0.37%，以5μm/l的17β-雌二醇處理，凋亡率為7.71%±0.33%，以10μm/l的17β-雌二醇處理，凋亡率為3.19%±0.30%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即17β-雌二醇抗雙氧水引起大鼠髓核細(xì)胞的凋亡具有劑量依賴性。
　　5凋亡蛋白caspas

16、e-3在各個(gè)實(shí)驗(yàn)分組大鼠髓核細(xì)胞中的表達(dá)含量是用Western blot技術(shù)來檢測(cè)。其結(jié)果顯示：當(dāng)對(duì)照組、雙氧水濃度依次為1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l時(shí)的灰度值（/GAPDH）分別為：0.16±0.03、0.24±0.02、0.32±0.02、0.39±0.03、0.41±0.04。其組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比較在500μm/l雙氧水條件下細(xì)胞經(jīng)過1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、

17、24小時(shí)后的灰度值（/GAPDH）分別為：0.17±0.03、0.25±0.02、0.37±0.02、0.38±0.03、0.40±0.04。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即雙氧水引起大鼠髓核細(xì)胞活性降低具有時(shí)間依賴性。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞6小時(shí)后，以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-雌二醇處理細(xì)胞，與對(duì)照組相比其灰度值（/GAPDH）分別為：0.32±0.02、0.23±0.02、0.13±0.0

18、2、0.09±0.03。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6轉(zhuǎn)錄凋亡蛋白caspase-3的基因表達(dá)含量運(yùn)用了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)對(duì)照組、雙氧水濃度依次為1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l時(shí)的相對(duì)ct值（/GAPDH）分別為：0.25±0.03、0.43±0.02、0.65±0.02、1.01±0.03、1.07±0.04。其組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比較在500μm/l雙氧水條

19、件下細(xì)胞經(jīng)過1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后的相對(duì)ct值（/GAPDH）分別為：0.42±0.03、0.61±0.02、0.92±0.02、1.08±0.03、1.12±0.04。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以500μm/l的雙氧水處理大鼠髓核細(xì)胞6小時(shí)后，以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-雌二醇處理細(xì)胞，與對(duì)照組相比其相對(duì)ct值（/GAPDH）分別為：0.79±0.02、0.58±0.02、0.41±