17β-雌二醇通過整聯(lián)蛋白α1β1和α2β1抗大鼠髓核細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的:探索胞膜整聯(lián)蛋白α1β1、α2β1參與的17β-雌二醇抗大鼠腰椎間盤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　方法:酶消化法原代培養(yǎng)大鼠髓核細(xì)胞，貼壁細(xì)胞融合為單層時，用含EDTA的0.2％的胰酶消化傳代.細(xì)胞生長至第3代時，用不含胎牛血清、不含酚紅的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，按以下分組實驗，每組均為6個樣本。對照組:加入少量乙醇作為對照;雌激素組:加入17β-雌二醇干預(yù);雌激素+抑制劑組:加入17β-雌二醇和雌激素受體(ER)抑制劑IC

2、I182780干預(yù)。細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，應(yīng)用:(1)免疫細(xì)胞化學(xué)法行Ⅱ型膠原染色鑒定髓核細(xì)胞;(2)行流式細(xì)胞術(shù)以及TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡;(3)細(xì)胞-膠原粘附實驗檢測細(xì)胞與Ⅰ、Ⅱ型膠原的粘附水平;(4)western印跡法對整聯(lián)蛋白亞基α1，α2，β1定量檢測。
　　結(jié)果:(1)原代腰椎髓核細(xì)胞呈多角形或長梭形，輪廓清楚，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)可見分泌顆粒，24～48 h細(xì)胞貼壁，7～8 d細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，可傳6～8

3、代，并分泌Ⅱ型膠原。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原呈陽性，髓核細(xì)胞純度較高。(3) TUNEL法檢測到雌激素可以有效地降低髓核細(xì)胞凋亡發(fā)生率;流式細(xì)胞術(shù)檢測:髓核細(xì)胞早期凋亡率:對照組為4.00％±0.16％;雌激素組為0.41％±0.19％;雌激素+抑制劑組為3.20％±0.05％。細(xì)胞晚期凋亡率:對照組為2.01％±0.18％;雌激素組為0.50％±0.10％;雌激素+抑制劑組為2.63％±0.20％。各組細(xì)胞凋亡率的差異

4、有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.20，P＜0.001）。雌激素組凋亡率低于對照組(P＜0.01)和雌激素+抑制劑組(P＜0.01)，對照組與雌激素+抑制劑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。(4)細(xì)胞與Ⅱ型膠原粘附實驗:各組OD值（吸光度）:對照組為0.60±0.03，95％CI(0.53，0.68);雌激素組為0.73±0.04，95％CI(0.63，0.83)，雌激素+抑制劑組為0.55±0.07，95％CI(0.37，0.73)。各組細(xì)胞對Ⅰ型膠原的粘附

5、水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，對Ⅱ型膠原的粘附水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.68，P＜0.05)，雌激素組高于對照組（P＜0.05）和雌激素+抑制劑組(P＜0.001)，對照組與雌激素+抑制劑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。(5)整聯(lián)蛋白α2亞基條帶的相對灰度值(/β-actin):對照組為0.23±0.005，95％CI(0.22，0.24);雌激素組為0.51±0.019，95％CI(0.46，0.55);雌激素+抑制劑組為0.21±

6、0.009，95％CI(0.18，0.23)。整聯(lián)蛋白β1亞基條帶的相對灰度值(/β-actin):對照組為0.26±0.011，95％CI(0.24，0.29);雌激素組為0.50±0.031，95％CI(0.43，0.58);雌激素+抑制劑組為0.25±0.018，95％CI(0.20，0.29)。整聯(lián)蛋白α1亞基表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。α2和β1亞基表達(dá)水平均有統(tǒng)計學(xué)差異，雌激素組高于對照組(P＜0.01)和雌激