BMP9誘導(dǎo)永生化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨效應(yīng)及p300參與永生化機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：來源于健康新生嬰兒的圍產(chǎn)期醫(yī)療廢棄物-臍帶的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）具有自我更新和多向分化潛能，其理想的成骨分化潛能在骨組織再生工程方面的臨床應(yīng)用中有巨大潛力。BMPs（Bone morphogenetic protein，骨形態(tài)發(fā)生蛋白）在MSCs的成骨分化過程中具有重要調(diào)控作用，其中以BMP9的誘導(dǎo)分化效應(yīng)尤為明顯，在hU

2、C-MSCs上的應(yīng)用有待于進(jìn)行深入研究。
　　原代hUC-MSCs分離步驟繁瑣，獲取途徑有限，體外擴(kuò)增培養(yǎng)要求較高，不同實(shí)驗(yàn)室間易出現(xiàn)差異；這些技術(shù)缺點(diǎn)限制了其功能和機(jī)制研究方面的進(jìn)一步深入，因此，需要尋求hUC-MSCs的規(guī)?；囵B(yǎng)和基礎(chǔ)應(yīng)用的新方法，干細(xì)胞永生化是解決這一難題的重要可行性途徑之一，有效避免培養(yǎng)過程中細(xì)胞老化，干性逐漸消失的現(xiàn)象。
　　本課題運(yùn)用前期構(gòu)建的PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)“無痕”導(dǎo)入SV40大 T抗

3、原基因，構(gòu)建永生化的hUC-MSCs細(xì)胞，對(duì)干細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞表面分子標(biāo)記，增殖活性和分化能力等一系列生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMP9誘導(dǎo) iUC-MSCs（ immortalized human umbilical cord mesenchymal stem cells）的成骨分化效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制研究，為hUC-MSCs在骨組織工程方面的應(yīng)用提供的理論依據(jù)。
　　第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及永生化細(xì)胞株的構(gòu)建

4、>　　目的：分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并構(gòu)建永生化細(xì)胞。
　　方法：采用Ⅰ型膠原酶消化法從臍帶組織中分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，體外連續(xù)培養(yǎng)傳代，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記，hUC-MSCs轉(zhuǎn)染pMPH86質(zhì)粒DNA和具有轉(zhuǎn)座酶活性的Ad-GFP-Base，潮霉素B抗性篩選陽性細(xì)胞克隆群，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，連續(xù)培養(yǎng)傳代并分批次凍存；WB檢測(cè)iUC-MSCs中SV40T的蛋白表達(dá)，將表達(dá)翻轉(zhuǎn)重組酶活性的Ad-FLP感染iUC-MS

5、Cs后 RT-PCR檢測(cè)處理后細(xì)胞的SV40Tag基因表達(dá)。
　　結(jié)果：成功分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，可見細(xì)胞形態(tài)大多呈長梭形及少量多角形，呈集落樣增殖；間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物 CD73， CD90， CD105均為陽性表達(dá)，而CD34，CD45和HLA-DR均為陰性表達(dá)；hUC-MSCs轉(zhuǎn)染后通過潮霉素B抗性篩選得到細(xì)胞克隆群，形態(tài)與原代細(xì)胞相似，SV40T蛋白呈陽性表達(dá)，F(xiàn)LP處理后，RT-PCR結(jié)果顯示iUC-MSCs

6、的SV40T基因被敲除。
　　結(jié)論：通過PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)導(dǎo)入SV40T，成功構(gòu)建iUC-MSCs并通過FLP的基因重組效應(yīng)逆轉(zhuǎn)永生化，為進(jìn)一步研究hUC-MSCs的自我更新和多向分化潛能獲得了理想的細(xì)胞模型。
　　第二部分 BMP9誘導(dǎo)永生化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化潛能鑒定
　　目的：鑒定iUC-MSCs的生物學(xué)特性和BMP9誘導(dǎo)其成骨、成脂、成軟骨分化潛能。
　　方法：檢測(cè)iUC-MSCs的表面分子標(biāo)

7、記，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT、結(jié)晶紫染色比較hUC-MSCs和iUC-MSCs的增殖活性，經(jīng)FLP處理后比較細(xì)胞增殖活性；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其生物安全性，iUC-MSCs經(jīng)BMP9誘導(dǎo)后三向分化能力的鑒定：RT-qPCR對(duì)三系分化相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)ALP活性，茜素紅和油紅O染色分別檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)和脂滴的形成；裸鼠皮下注射BMP9誘導(dǎo)分化iUC-MSCs建立成骨模型，觀察皮下包塊的形成，對(duì)離體骨進(jìn)行Micro-CT掃描分析，脫鈣處理

8、并進(jìn)行H&E，油紅O，Alcian Blue和 Masson Trichrome組化染色并觀察比較。
　　結(jié)果：iUC-MSCs表面分子標(biāo)記基本符合干細(xì)胞特征，細(xì)胞增殖能力較原代細(xì)胞更強(qiáng)，經(jīng)FLP處理后增殖活性有所降低，但仍能傳4-5代；移植到裸鼠體內(nèi)的iUC-MSCs未形成異常增殖，證明其生物安全性良好；RT-PCR結(jié)果顯示經(jīng)BMP9刺激后，三系分化相關(guān)基因的mRNA水平均明顯增加，BMP9誘導(dǎo)iUC-MSCs的ALP活性亦明顯

9、增強(qiáng)，ALP染色的陽性表達(dá)，亦能夠促進(jìn)iUC-MSCs的鈣鹽沉積和脂滴形成；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和microCT、組織化學(xué)染色檢查顯示，iUC-MSCs經(jīng)BMP9誘導(dǎo)后在裸鼠皮下注射位點(diǎn)異位成骨，成脂、成軟骨。
　　結(jié)論：iUC-MSCs的增殖活性較原代細(xì)胞更好，體內(nèi)外經(jīng)BMP9誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)其具有成骨、成脂、成軟骨的多向分化潛能。
　　第三部分 P300參與調(diào)控臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞永生化相關(guān)機(jī)制的研究
　　目的：檢測(cè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外

10、長期培養(yǎng)過程中自我更新、細(xì)胞衰老和誘導(dǎo)分化能力等特性的改變，早/晚期代數(shù)原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞之間比較P300和多潛能轉(zhuǎn)錄因子的基因和蛋白表達(dá)水平的變化，探討與永生化相關(guān)可能機(jī)制。
　　方法：檢測(cè)hUC-MSCs早期（P3-5）和晚期（P15,P25）細(xì)胞增殖能力，克隆形成能力的差異，經(jīng)BMP9誘導(dǎo)后ALP活性讀數(shù)的比較；細(xì)胞衰老特異性β-gal染色檢測(cè)hUC-MSCs早期和晚期細(xì)胞，F(xiàn)LP處理和未處理的永生化細(xì)胞的細(xì)胞衰老水平，R

11、T-qPCR和WB檢測(cè)p300和多潛能轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的變化，及β-catenin不同位點(diǎn)磷酸化水平的變化。
　　結(jié)果：hUC-MSCs晚期細(xì)胞的增殖活性、CFU-F、成骨早期指標(biāo)ALP活性均明顯低于早期細(xì)胞，細(xì)胞衰老特異性β-gal活性明顯增強(qiáng)，而永生化細(xì)胞未表達(dá)β-gal活性， FLP處理后廣泛性低水平表達(dá)β-gal活性。hUC-MSCs晚期和永生化細(xì)胞的p300基因mRNA表達(dá)水平明顯下降，而蛋白水平恢復(fù)至早期細(xì)胞表達(dá)水平，

12、Nanog基因表達(dá)水平變化與p300蛋白表達(dá)變化相類似，而Oct4和Sox2則沒有顯著性差異；β-catenin的S675位點(diǎn)磷酸化水平與p300/Nanog表達(dá)水平變化相類似。
　　結(jié)論：hUC-MSCs長期培養(yǎng)過程中干性有所衰減，永生化細(xì)胞則保持干性，p300/Nanog與β-catenin的S675位點(diǎn)磷酸化參與了轉(zhuǎn)化調(diào)控。
　　第四部分 Mir-26b-5p下調(diào)p300對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用研究
　　目的：

13、探討潛在microRNA靶向下調(diào) p300表達(dá)水平對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　方法：通過雙熒光素酶報(bào)告基因（Firefly/Renilla Luciferase）系統(tǒng)篩選出作用于 p3003'-UTR的目標(biāo) microRNA， mimic轉(zhuǎn)染 UC-MSCs后RT-qPCR檢測(cè)miRNA表達(dá)水平的變化，Western Blotting檢測(cè)p300蛋白水平變化，RT-qPCR和Western-bloting檢測(cè)多潛能

14、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的變化，MTT法檢測(cè)UC-MSCs增殖能力的變化，并比較克隆形成能力的差異。
　　結(jié)果：證實(shí)mir-26b-5p通過不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合p300的3’-UTR區(qū)，顯著降低了熒光素酶的相對(duì)活性；mir-26b-5p mimic轉(zhuǎn)染后抑制p300蛋白表達(dá)水平，并下調(diào)Nanog基因和蛋白表達(dá)水平；mir-26b-5p mimic轉(zhuǎn)染后UC-MSCs的增殖受到抑制，克隆形成能力下降。
　　結(jié)論：UC-MSCs高表達(dá)mi