紅細胞凍干保存影響因素的初步研究.pdf

1、紅細胞長期保存是輸血醫(yī)學(xué)中的重要研究課題，凍干法是實現(xiàn)紅細胞長期保存的方法之一。早在上世紀60年代，就有學(xué)者嘗試以凍干的方式保存紅細胞。至上世紀90年代，紅細胞的凍干保存成為低溫生物醫(yī)學(xué)研究的熱點，國內(nèi)外的數(shù)個研究小組對凍干保護劑的篩選和凍干、復(fù)水過程等環(huán)節(jié)進行了大量的研究。在此過程中，發(fā)現(xiàn)凍干的紅細胞總有一部分水難以去除，將這部分水定義為“殘余水分”。殘余水相關(guān)問題是目前紅細胞凍干保存研究遇到的爭議和瓶頸之一。近年來，發(fā)現(xiàn)甘油作為滲透

2、性保護劑，進入細胞內(nèi)與細胞蛋白、脂質(zhì)形成氫鍵，降低了電解質(zhì)的濃度，減少了胞內(nèi)冰的形成，與PVP等非滲透性的保護劑聯(lián)合使用，保護效果較好。但是甘油有保濕護水作用，不利于干燥，這與去除水分又相矛盾，可見對于保護劑中甘油與殘余水的問題還有很多工作去做。
　　本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上對紅細胞凍干保護劑中甘油濃度及與殘余水的關(guān)系、凍干紅細胞殘余水含量測定方法等問題進行了初步研究。
　　目的:本實驗在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，對保護

3、劑中甘油濃度、凍干程序（擱板溫度、干燥時間）及保存時間與細胞回收率、溶血率、殘余水含量的關(guān)系進行了研究;同時，對凍干紅細胞回收率、殘余水含量測定等技術(shù)方法進行了對比分析，為進一步探討紅細胞凍干殘余水對紅細胞凍干保存的影響提供理論及實驗基礎(chǔ)。
　　方法:用不同甘油濃度保護劑處理紅細胞，設(shè)置不同擱板溫度及次級干燥時間，用普通光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)，用計數(shù)板、全自動血球計數(shù)儀計數(shù)紅細胞，氰化高鐵法測定血紅蛋白，分析細胞復(fù)水、洗脫保護劑恢

4、復(fù)等滲后細胞回收率、溶血率情況。用熱重法、Karl-Fischer化學(xué)法及其改進方法測定凍干紅細胞水含量，對比不同方法的結(jié)果，分析不同保護劑組的凍干紅細胞剩余水含量變化情況。
　　結(jié)果:1、本研究所用保護劑中不同甘油濃度(3％，6％，9％，12％，15％，18％，21％)(w/v)對紅細胞凍干保存的影響:各組凍干復(fù)水后的紅細胞形態(tài)正常，凍干紅細胞殘余含水量為(11.53±0.33)％～（35.32±1.53）％，細胞回收率為(51

5、.04±6.14)％～（84.37±8.62）％，細胞溶血率為（15.86±2.23）％～(43.43±6.51)％。殘余含水量隨甘油濃度的增大而升高，具有很好的相關(guān)性，R2=0.9963;9％，12％，15％三組細胞復(fù)水回收率、溶血率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.076)，細胞凍干保存效果較好與其余各組之間差異有顯著性(P＜0.01)。
　　2、不同擱板溫度-60℃，-50℃，-40℃，-30℃組，洗脫保護劑后細胞回收率分別為58.

6、50±7.29，22.67±2.10，21.52±1.70，29.73±1.35，細胞溶血率分別為77.55±3.26，82.31±1.16，85.30±1.35，84.37±0.62，殘余水含量分別為25.18±0.19，22.12±1.46，23.02±1.25，26.19±0.58。當擱板溫度為-60℃、次級干燥時間為2h時，紅細胞凍干保存效果最優(yōu)，洗脫保護劑后細胞回收率、溶血率與其余各組比較差異有顯著性(P＜0.01)。不延長次

7、級干燥時間組(次級干燥2h)，紅細胞凍干保存效果優(yōu)于延長次級干燥時間組(次級干燥2h后再延長24h)，差異有顯著性(P＜0.01)，兩組凍干紅細胞殘余水含量差異無顯著性，P=0.273。紅細胞凍干后隨著保存時間延長，細胞回收率呈下降趨勢，不同保存時間段溶血率無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3、凍干紅細胞洗脫保護劑恢復(fù)等滲后計數(shù)，儀器計數(shù)結(jié)果為（2.29±0.08）×1012，手工計數(shù)結(jié)果為（0.71±0.11）×1012，差異

8、有顯著性(P＜0.01)。Karl-Fischer法、Karl-Fischer聯(lián)合卡式爐法、Karl-Fischer法聯(lián)合質(zhì)量差法及熱重法，測定凍干紅細胞剩余水含量百分比分別為（3.20±0.52）％，(6.70±1.22)％，(10.07±0.19)％，(25.18±0.42)％，結(jié)果有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.本實驗所用紅細胞凍干保存保護劑配方最適甘油濃度為(9～15)％(w/v)，最適擱板溫度為

9、-60℃，次級干燥時間為2h;
　　3.甘油濃度與殘余含水量具有線性相關(guān)性，可以采用不同甘油濃度來控制殘余水含量;
　　3.熱重法較Karl-Fischer法、KF聯(lián)合質(zhì)量差法及KF聯(lián)合卡式爐法——檢測殘余含水量結(jié)果偏高;KF聯(lián)合卡式爐法能有效避免樣本溶解不完全問題，測量結(jié)果準確性高于單純的Karl-Fischer法;
　　4.當紅細胞發(fā)生損傷時，應(yīng)用計數(shù)板法測定凍干紅細胞回收率，可有效避免損傷細胞對計數(shù)結(jié)果準確性造成