miR-522調(diào)控人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　研究miR-522在惡性腦膠質(zhì)母細胞瘤中的表達情況，并探究惡性腦膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)中miR-522異常表達的臨床意義;進一步研究miR-522對GBM細胞增殖的調(diào)控作用，以及作用機制。
　　方法：
　　將miR-522模擬物或miR-522抑制劑轉(zhuǎn)染到GMB細胞中，MTT和克隆形成實驗檢測GBM細胞增殖能力的變化。分別用qRT-PCR和蛋白印跡法檢測miR-522和PHLPP1的表達變化，Targets

2、can軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告實驗驗證miR-522和PHLPP1的相互作用。
　　結(jié)果：
　　1.miR-522在人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織和細胞中顯著高表達。通過QPCR檢測，我們可以明顯發(fā)現(xiàn)，相較于正常腦組織，miR-522在腦膠質(zhì)母細胞瘤組織中顯著高表達;我們在腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞中進一步驗證了這一結(jié)果，相對于正常腦星形細胞(NHA)，miR-522也明顯高表達。
　　2.miR-522促進人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖。

3、使用miR-522 mimics轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87MG。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，細胞轉(zhuǎn)染miR-522mimics后其表達水平顯著上調(diào)。而且，MTT實驗，克隆形成實驗和錨著非依賴性生長實驗，分別證明了miR-522對腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞的生長促進作用。
　　3.抑制miR-522的表達水平可以抑制U87MG細胞的增殖。當(dāng)我們抑制miR-522的表達水平時，我們發(fā)現(xiàn)U87MG細胞的增殖能力減弱。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，細胞

4、轉(zhuǎn)染miR-522 inhibitor后其表達水平顯著下調(diào)。而且，MTT實驗，克隆形成實驗和錨著非依賴性生長實驗，分別證明了抑制miR-522的表達后，腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87MG的生長受到抑制。
　　4.miR-522靶向調(diào)節(jié)PHLPP1及其他調(diào)節(jié)細胞增殖的因子。首先，我們利用生物信息學(xué)的方法(TargetScan Human6.2)，分析發(fā)現(xiàn)，miR-522的種子序列和抑癌基因PHLPP1的3'UTR序列互補結(jié)合。我們分別用m

5、iR-522 mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染U87MG細胞。Western blot實驗表明，當(dāng)U87MG外源性表達miR-522時，可以顯著下調(diào)PHLPP1蛋白分子的表達情況。而且，如果人為抑制miR-522的表達水平，PHLPP1蛋白的表達反而會出現(xiàn)顯著上調(diào)情況。接下來，我們利用報告基因?qū)嶒炦M一步確認miR-522對PHLPP1的調(diào)控作用，我們分別構(gòu)建了PHLPP1的野生型和突變型3'UTR，然后將其與miR-522 mimi

6、cs或者inhibitor共轉(zhuǎn)U87MG細胞。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示:miR-522過表達可以顯著下調(diào)PHLPP1的野生型3' UTR的熒光素酶活性，而抑制miR-522的表達可以顯著上調(diào)PHLPP1的野生型3' UTR的熒光素酶活性。但是，兩者對PHLPP1的突變型3'UTR的熒光素酶活性，沒有調(diào)節(jié)作用。因而我們的實驗結(jié)果證明了miR-522負向調(diào)控PHLPP1的表達，這一調(diào)控作用是通過直接靶向其3' UTR的潛在結(jié)合位點實現(xiàn)的。同

7、時，我們也檢測了一些調(diào)控細胞增殖過程的關(guān)鍵分子。結(jié)果表明，當(dāng)我們在U87MG細胞中過表達miR-522時，p27的蛋白表達水平和Mrna表達水平都顯著下調(diào)。我們同時也發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)CDK并對細胞增殖其關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的分子，cyclin D1，當(dāng)過表達miR-522時，其蛋白和Mrna水平顯著上調(diào);當(dāng)抑制miR-522的表達時，其蛋白和Mrna水平顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明，miR-522可以調(diào)節(jié)細胞增殖調(diào)控因子，比如p27和cyclin D1，進

8、而影響細胞增殖過程。
　　5.PHLPP1下調(diào)參與了miR-522對腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖調(diào)控作用。我們設(shè)計了特異性抑制細胞U87MG-miR-522-in來抑制miR-522的表達水平。借助siRNA，我們成功地降低了PHLPP1的表達水平。而且，克隆形成實驗和錨著非依賴性生長實驗，分別證明了降低PHLPP1的表達水平可以促進U87MG-miR-522-in細胞的增殖。
　　結(jié)論：
　　因此，我們的初步研究結(jié)果表明