EGCG和PC-B2對(duì)AFB1致肝細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用與機(jī)制研究.pdf

1、黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)中以黃曲霉毒素B1(AFB1)最常見、毒性最大、致癌性最強(qiáng)，主要損害肝臟并易誘發(fā)肝癌，屬于Ⅰ類強(qiáng)致癌物。在抵抗AFB1毒作用的藥物研究中，植物多酚類化學(xué)物(PolyphenolsPhytochemicals)愈來愈受到人們的關(guān)注。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate，EGCG)作為綠茶主要活性成分，具有抗氧化、抗突變、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體免疫力的效果，是兒

2、茶素類化合物中生物學(xué)效應(yīng)最強(qiáng)的一種。原花青素B2(PC-B2)是植物界中一類廣泛存在的天然多酚類化合物，屬于強(qiáng)抗氧化劑，可以有效清除人與動(dòng)物體內(nèi)多余的自由基，保護(hù)細(xì)胞及組織免受氧化損傷。PC-B2藥理作用廣泛，具有保護(hù)心血管、預(yù)防高血壓、抗輻射、抗突變、抗腫瘤等作用。本研究擬通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，探討EGCG與PC-B2對(duì)AFB1染毒后的人胚肝細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用，具體研究過程如下:
　　第一部分 AFB1對(duì)L-02細(xì)胞生

3、存率、凋亡率及DNA損傷的影響
　　目的:探討不同濃度AFB1對(duì)體外培養(yǎng)人胚肝細(xì)胞（L-02細(xì)胞）生存率、凋亡率及DNA損傷的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)L-02細(xì)胞，采用AFB1進(jìn)行干預(yù)，AFB1用藥濃度分別為:0、5、10、20、40、80mg/L AFB1。倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(SCGE)觀察細(xì)胞DNA損傷情況。結(jié)果與對(duì)照組比較

4、，10mg/L及以上濃度AFB1干預(yù)48h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，低濃度下表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、體積變小，高濃度下細(xì)胞皺縮變?yōu)閳A形，出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞及細(xì)胞碎片，形態(tài)學(xué)變化的程度與AFB1濃度有關(guān)。10mg/L及以上濃度AFB1作用48h后存活率均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）;5mg/L及以上濃度AFB1作用48h后凋亡率均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）;且10mg/L及以上濃度AFB1干預(yù)存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著AFB1作用濃度的增加，L-02

5、細(xì)胞存活率減少（P＜0.05），凋亡率增加（P＜0.05）。
　　結(jié)果:與對(duì)照組比較，AFB1作用L-02細(xì)胞48h后，10mg/L及以上濃度組細(xì)胞彗星尾部DNA百分率、Olive尾距增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著AFB1濃度的增加，L-02細(xì)胞的DNA損傷增大。
　　結(jié)論:10mg/L及以上濃度AFB1有細(xì)胞毒性、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)以及損傷細(xì)胞的DNA的作用;5mg/L及以上濃度AFB1能提高

6、細(xì)胞凋亡率;隨著AFB1濃度的升高，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系;40mg/L濃度AFB1能有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、造成較嚴(yán)重的細(xì)胞DNA損傷，但不至于立刻導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因而40mg/L濃度被選為后續(xù)試驗(yàn)的參考濃度。
　　第二部分 EGCG與PC-B2對(duì)AFB1致L-02細(xì)胞生存率、凋亡率、DNA損傷以及Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53基因表達(dá)的影響
　　目的:探討EGCG與PC-B2對(duì)AFB1致體外培養(yǎng)人

7、胚肝細(xì)胞(L-02細(xì)胞)生存率、凋亡率、DNA損傷以及、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53基因表達(dá)的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)L-02細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)立6組:(1)空白對(duì)照組:L-02細(xì)胞僅給予培養(yǎng)液;(2)溶劑對(duì)照組給予加2％DMSO溶劑的培養(yǎng)液;(3)AFB1染毒組:L-02細(xì)胞經(jīng)40mg/L的AFB1單獨(dú)作用;(4) EGCG組:L-02細(xì)胞在AFB1染毒同時(shí)給予50mg/L的EGCG作用;(5)

8、 PC-B2組:L-02細(xì)胞在AFB1染毒同時(shí)給予200 mg/L的PC-B2;(6) EGCG與PC-B2組:L-02細(xì)胞在AFB1染毒同時(shí)給予50mg/L的EGCG與200 mg/L的PC-B2。以上各組2天換液一次，3-5天傳代一次，一周后，觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(SCGE)觀察細(xì)胞DNA損傷情況，采用Western blot法分析Bcl-2、Bax

9、、caspase-3、caspase-9、P535個(gè)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)與對(duì)照組比較，AFB1染毒組能顯著抑制L-02細(xì)胞生長(zhǎng)，EGCG與PC-B2均能降低AFB1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，使生長(zhǎng)抑制率從61.12％降至42.18％和46.72％; EGCG與PC-B2聯(lián)用則使AFB1對(duì)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率從61.12％降至37.15％。SCGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGCG與PC-B2單用/聯(lián)用均能減小AFB1引起的L-02細(xì)胞DNA

10、損傷（P＜0.05），其彗星Olive尾矩值分別為AFB1染毒組9.72±2.64，EGCG組5.91±1.79，PC-B2組5.36±1.17; EGCG+PC-B2組4.47±1.27。實(shí)驗(yàn)各組L-02細(xì)胞經(jīng)處理后，早期凋亡率(％)分別為空白對(duì)照組2.63±0.28，溶劑對(duì)照組3.01±0.45，AFB1染毒組13.63±3.79，EGCG組8.26±1.67，PC-B2組7.89±1.52，EGCG+PC-B2組4.68±0.51

11、，實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈顯著性差異（P＜0.05）;與溶劑對(duì)照組相比，AFB1染毒組能上調(diào)caspase-3、caspase-9的表達(dá)(P＜0.05)，下調(diào)bcl-2/Bax(P＜0.05);而EGCG組與PC-B2組中表明，EGCG與PC-B2單用均能下調(diào)caspase-3、caspase-9的表達(dá)(P＜0.05)，顯著上調(diào)bcl-2/Bax(P＜0.05)，而EGCG與PC-B2兩者聯(lián)用時(shí)，對(duì)caspase-3、caspase-9、bcl-2/

12、Bax的影響更為顯著（P＜0.05）;無論是EGCG與PC-B2單用還是聯(lián)用，對(duì)P53的表達(dá)水平影響不明顯。
　　結(jié)論:AFB1能顯著抑制L-02肝細(xì)胞的生長(zhǎng)，并使細(xì)胞的DNA損傷程度加重; EGCG與PC-B2單用或聯(lián)用可提高細(xì)胞的生存率，降低細(xì)胞凋亡率與DNA損傷程度;EGCG與PC-B2對(duì)AFB1長(zhǎng)時(shí)間暴露的L-02細(xì)胞caspase-3、caspase-9基因的表達(dá)顯著下調(diào)，bcl-2/Bax比值顯著升高，EGCG與PC-