金黃色葡萄球菌RNase Ⅲ的催化機理研究和動粒蛋白Mis12復合物與相關蛋白的相互作用研究.pdf

1、雙鏈RNA（dsRNA）可由初級轉錄本互補配對產生，在細胞中廣泛存在，并發(fā)揮多種生物學效應。而且，dsRNA也是許多病毒的遺傳物質。在細菌和真核細胞中，RNaseⅢ家族（核糖核酸內切酶Ⅲ）的成員選擇性地識別和剪切dsRNA，在基因表達和調控，宿主防御和基因組監(jiān)控等過程中扮演著重要的角色。RNaseⅢ家族成員對dsRNA的加工是編碼RNA和非編碼RNA成熟和衰變過程中的關鍵步驟，甚至在miRNA和siRNA的生成中也起著重要作用。RNas

2、eⅢ是二價金屬離子依賴的磷酸二酯酶。RNaseⅢ家族成員有一個獨特的RNaseⅢ結構域，以二聚體形式發(fā)揮其酶活，結合dsRNA，并剪切每條鏈上的磷酸二酯鍵，產生一個特征性的3'端有2個核苷酸突起的產物。
　　為了了解金黃色葡萄球菌RNaseⅢ與其他細菌RNaseⅢ之間的異同，我們解析了金黃色葡萄球菌RNaseⅢ的晶體結構，并對其進行了分析。我們發(fā)現金黃色葡萄球菌RNaseⅢ與其他細菌RNaseⅢ整體結構相似，兩個RNaseⅢ結構域

3、通過疏水作用形成緊密的二聚體，同時參與金屬離子配位的活性中心關鍵氨基酸殘基也是保守的。通過體外酶活實驗，我們發(fā)現:金黃色葡萄球菌RNaseⅢ在二價金屬離子條件下催化dsRNA底物的水解;不同二價金屬離子對金黃色葡萄球菌RNaseⅢ催化效率的影響有差異，相對于Mg2+，Mn2+條件下Sa-RNaseⅢ有更強的催化活性，Ca2+和Ni2+則會抑制其活性。而活性中心關鍵氨基酸殘基的突變會大大減弱Sa-RNaseⅢ的催化活性。
　　動粒是

4、一個大的蛋白網絡，在有絲分裂時期陸續(xù)組裝到著絲粒染色體上。它連接姐妹染色單體和紡錘體微管，促進姐妹染色單體準確分離到紡錘體的兩極。動粒主要由內層的CCAN蛋白網絡和外層的KMN蛋白網絡組成。KMN蛋白網絡主要由Knl1，Mis12復合物及Ndc80復合物組成。Mis12復合物是連接內外層動粒的橋梁，它與CENP-C發(fā)生相互作用而被招募至動粒，又通過與Knl1和Ndc80復合物的相互作用，招募其它外層動粒組分，進而促進動粒和微管的連接。盡

5、管關于外層動粒的研究很多，到目前為止，KMN蛋白網絡內Mis12復合物與Ndc80復合物相互作用的具體方式和調節(jié)機制還不是很清楚。在減數分裂Ⅰ期，姐妹染色單體的動粒結合到來自同一方向紡錘體的微管，稱為單極定向。在釀酒酵母中，單極定向主要依賴于四亞基的monopolin復合物。Monopolin復合物在減數分裂Ⅰ期結合到姐妹染色單體的動粒上，并促進單極定向。然而目前monopolin復合物在動粒上的結合位點以及發(fā)揮作用的機制還不是很清楚。

6、有研究發(fā)現，monopolin復合物亞基Csm1可能通過與MIND復合物（人源Mis12復合物在釀酒酵母中的同源物）亞基Dsn1相互作用，而將姐妹動粒機械融合，從而促進姐妹染色單體的單極定向。
　　我們嘗試通過體外重組表達的方法，來獲得純度較高的人源Mis12復合物亞基Dsn1和Nsl1的截短體與人源和裂殖酵母中的Ndc80bonsai蛋白，并嘗試通過體外pull-down方法檢測人源和裂殖酵母兩個物種中Ndc80復合物與Mis1