日本血吸蟲感染C57BL-6小鼠后B10細(xì)胞的免疫學(xué)特性研究.pdf

1、血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種人獸共患寄生蟲病，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)是一類具有免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用的B細(xì)胞亞群，通過分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，在自身免疫病、慢性炎癥、腫瘤及寄生蟲感染等疾病中發(fā)揮著免疫抑制作用。近年來研究表明，曼氏血吸蟲感染后可以誘導(dǎo)高分泌IL-10的Bregs(B10細(xì)胞)產(chǎn)生，并且在抑制自身免疫病過程中發(fā)揮重要的作用。課題組在前期工作中已經(jīng)證實(shí)日本血吸蟲蟲卵抗原(SEA)在體內(nèi)、體外均可以誘導(dǎo)產(chǎn)生B1

2、0細(xì)胞，然而，在血吸蟲感染不同階段B10細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化及其表型仍不明確，B10細(xì)胞對(duì)其他細(xì)胞的免疫調(diào)控作用仍不清楚。此外，日本血吸蟲感染誘導(dǎo)B10細(xì)胞活化的機(jī)制尚不明確。因此，我們對(duì)日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠后B10細(xì)胞的免疫學(xué)特性進(jìn)行了研究。
　　研究內(nèi)容分為3部分:
　　1.日本血吸蟲感染不同階段B10細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化
　　目的:通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察血吸蟲感染的不同階段B10細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。
　　方法:構(gòu)

3、建日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠的模型，分別在感染0w、3w、6w、13w，ELISA檢測(cè)血清中SEA特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a的變化，ELISA法檢測(cè)血清IL-10以及脾臟CD19＋B細(xì)胞體外培養(yǎng)上清中IL-10、IL-4、IFN-γ的水平，同時(shí)流式檢測(cè)脾臟中CD19＋I(xiàn)L-10＋B細(xì)胞的比例。感染13w時(shí)通過胸主動(dòng)脈灌注得到成蟲，KOH消化肝臟后顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵，計(jì)算每對(duì)成蟲產(chǎn)卵個(gè)數(shù)，同時(shí)鏡下觀察感染各時(shí)期肝臟的病理改

4、變。
　　結(jié)果:小鼠血清中，可溶性蟲卵抗原(SEA)特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體水平顯著增高。日本血吸蟲感染后的第6w和第13w，脾臟B細(xì)胞分泌的IL-10水平也顯著升高，IFN-γ以及IL-4水平無明顯改變。同時(shí)，感染后6w和13w，B10細(xì)胞比例也顯著增多。感染后第13w，可收集到成蟲，肝臟有沉積蟲卵和蟲卵肉芽腫的形成。
　　結(jié)論:在日本血吸蟲感染急性和慢性期，日本血吸蟲可以誘導(dǎo)小鼠脾臟產(chǎn)生B10細(xì)胞。

5、　　2.日本血吸蟲感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的B10細(xì)胞的表型和功能
　　目的:探索血吸蟲感染過程中B10細(xì)胞的表型和功能。
　　方法:感染第13w磁珠分離小鼠脾臟CD19＋B細(xì)胞，標(biāo)記表面抗體，流式檢測(cè)CD19＋CD1d＋CD5＋以及CD19＋Tim-1＋兩種B10細(xì)胞的比例，然后根據(jù)表型流式分選細(xì)胞，體外培養(yǎng)后檢測(cè)上清中IL-10水平，明確分泌IL-10的B細(xì)胞表型。根據(jù)表型流式分選B10細(xì)胞然后與磁珠分選出的CD4＋T細(xì)胞共孵育，同

6、時(shí)加入抗CD3抗體和抗CD28抗體，72h后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-4、IFN-γ以及IL-17的水平。
　　結(jié)果:CD19＋Tim-1＋B細(xì)胞高分泌IL-10，并且這群細(xì)胞能夠誘導(dǎo)活化的CD4＋T細(xì)胞分泌IL-4，并抑制IL-17的分泌。
　　結(jié)論:在日本血吸蟲感染過程中，CD19＋Tim-1＋B細(xì)胞可以對(duì)Th2和Th17細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。
　　3.日本血吸蟲誘導(dǎo)B10細(xì)胞活化機(jī)制的初步探討
　　目的

7、:研究日本血吸蟲誘導(dǎo)B10細(xì)胞活化的機(jī)制。
　　方法:體外用SEA、LPS分別刺激正常小鼠CD19＋B細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)CD19＋B細(xì)胞TLR2、TLR4以及IL-10的mRNA水平。磁珠分選正常小鼠和TLR4-/-小鼠脾臟CD19＋B細(xì)胞，SEA、LPS分別刺激72h后，流式檢測(cè)IL-10＋B細(xì)胞的比例，同時(shí)ELISA檢測(cè)上清中IL-10的水平。
　　結(jié)果:SEA和LPS刺激后，CD19＋B細(xì)胞TLR4以

8、及IL-10的mRNA的表達(dá)水平明顯升高;TLR4-/-小鼠CD19＋B細(xì)胞在SEA和LPS刺激后，IL-10＋B細(xì)胞比例以及分泌IL-10的量顯著低于正常小鼠。
　　結(jié)論:SEA誘導(dǎo)產(chǎn)生B10細(xì)胞部分依賴于TLR4途徑。
　　通過小鼠體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，對(duì)日本血吸蟲感染過程中B10細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化、表型、功能以及誘導(dǎo)B10細(xì)胞活化的機(jī)制的研究，有助于我們進(jìn)一步了解日本血吸蟲感染過程中的免疫調(diào)控機(jī)制，同時(shí)為探索血吸蟲感染疫苗研制提供了