細(xì)胞因子對(duì)NK細(xì)胞發(fā)育分化的調(diào)控.pdf

1、NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中具有抗腫瘤和抗病毒功能的重要效應(yīng)細(xì)胞。在病毒感染早期，NK細(xì)胞快速應(yīng)答殺傷被感染靶細(xì)胞。NK細(xì)胞發(fā)育分化、發(fā)揮功能等過程受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控。在誘導(dǎo)小鼠骨髓前體細(xì)胞發(fā)育分化體系中，SCF、IL-7、FLT31和IL-15被證明具有促進(jìn)NK細(xì)胞發(fā)育分化的功能。而體內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)更為復(fù)雜，能夠明確某一細(xì)胞因子對(duì)NK細(xì)胞的作用是十分重要的。關(guān)于細(xì)胞因子的功能研究一般依賴細(xì)胞因子或其受體的基因缺陷小鼠，從中可以了解細(xì)胞

2、因子在某些細(xì)胞亞群發(fā)育及功能上的作用。但是有時(shí)因代償作用，細(xì)胞因子信號(hào)途徑的缺失并不會(huì)引起任何變化。對(duì)小鼠給予外源細(xì)胞因子的補(bǔ)充是另一種研究思路，該方法可以明確當(dāng)體內(nèi)某種細(xì)胞因子含量升高時(shí)，對(duì)某細(xì)胞亞群的發(fā)育及功能的影響。但是通常細(xì)胞因子半衰期較短，需連續(xù)給藥，操作復(fù)雜，經(jīng)濟(jì)成本高。為此，我們構(gòu)建了免疫系統(tǒng)人源化小鼠以及人IL-21和鼠IL-28B兩種細(xì)胞因子過表達(dá)載體，通過高壓注射的方式將載體導(dǎo)入小鼠肝細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞因子的持續(xù)供

3、給。在此基礎(chǔ)上，分別研究?jī)煞N細(xì)胞因子對(duì)人NK細(xì)胞和小鼠NK細(xì)胞發(fā)育分化的影響。
　　1.過表達(dá)hIL-21促進(jìn)人源化小鼠中NK細(xì)胞的發(fā)育分化
　　免疫系統(tǒng)人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠中，植入人的造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或組織而使其具有人的免疫系統(tǒng)的小鼠模型。經(jīng)過三十幾年的不斷改進(jìn)，人源化小鼠模型已日益完善，但是在已有的人源化小鼠模型中，人NK細(xì)胞的重建仍是一大難題。當(dāng)受者小鼠的自身免疫功能過強(qiáng)時(shí)，人源NK細(xì)胞難以重建，而當(dāng)受者小鼠

4、的自身免疫功能進(jìn)一步缺陷，人NK細(xì)胞重建水平只得到微弱提高。當(dāng)外源給予hIL-15時(shí)，往往重建的NK細(xì)胞比例超過生理水平，導(dǎo)致細(xì)胞組成失調(diào)。圍繞著如何建立一個(gè)具有生理水平NK細(xì)胞的理想人源化小鼠模型，我們開展了一系列研究工作，主要結(jié)果如下:
　　1)我們采用人外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給T細(xì)胞、B細(xì)胞缺陷的NOD/SCID小鼠進(jìn)行人源化免疫系統(tǒng)重建。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然在小鼠各臟器中可以檢測(cè)到較高比例的人源免疫細(xì)胞，但是僅表現(xiàn)為人源免疫細(xì)胞的

5、直接植入，而沒有由人源造血干細(xì)胞的發(fā)育分化而來的免疫細(xì)胞。
　　2)由于人外周血單個(gè)核細(xì)胞中造血干細(xì)胞的比例較低，由造血干細(xì)胞發(fā)育分化出免疫細(xì)胞的概率較低。為此，我們采用臍帶血造血干細(xì)胞為供者細(xì)胞，轉(zhuǎn)輸給NOD/SCID小鼠進(jìn)行人源化免疫系統(tǒng)重建。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠各臟器中均重建出較高比例的人源免疫細(xì)胞，但是T細(xì)胞和NK細(xì)胞的重建水平較低，揭示受者小鼠中殘存的NK細(xì)胞仍是人源化免疫系統(tǒng)重建的障礙。
　　3)為了降低受者鼠NK細(xì)胞

6、的影響，我們采用臍帶血造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞均缺陷的NOG小鼠。結(jié)果表明，與NOD/SCID小鼠相比，免疫系統(tǒng)人源化重建水平顯著提高，重建時(shí)間縮短。
　　4)為了使NK細(xì)胞能夠在一個(gè)模擬人的環(huán)境中發(fā)育分化，我們?cè)贜OG小鼠中過表達(dá)hIL-21并轉(zhuǎn)輸臍帶血造血干細(xì)胞重建人源化免疫系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hIL-21的持續(xù)表達(dá)顯著促進(jìn)了人源化NK細(xì)胞的發(fā)育分化，并且其NK細(xì)胞比例與生理狀況相接近。
　　5)進(jìn)而對(duì)免疫系

7、統(tǒng)人源化小鼠進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)人源化免疫細(xì)胞在免疫器官中廣泛分布。通過對(duì)CD4和CD8分子的檢測(cè)及分析，表明人源化T細(xì)胞在小鼠胸腺中可以完成陽(yáng)性選擇。
　　以上結(jié)果表明，我們?cè)贜OG小鼠中成功構(gòu)建了人源免疫系統(tǒng)，并通過實(shí)現(xiàn)hIL-21在小鼠體內(nèi)的持續(xù)性表達(dá)，提高了人源化免疫系統(tǒng)的重建，尤其是促進(jìn)了人NK細(xì)胞的發(fā)育分化。除此之外，人源化T細(xì)胞在小鼠的胸腺內(nèi)能夠完成陽(yáng)性選擇，發(fā)育為成熟T細(xì)胞到達(dá)外周。該人源化小鼠模型將為人NK細(xì)胞生

8、物學(xué)研究提供一個(gè)有力的動(dòng)物模型。
　　2.IL-28B促進(jìn)小鼠NK細(xì)胞的增殖和成熟
　?、笮透蓴_素是新近發(fā)現(xiàn)的干擾素家族成員，主要包括IFN-λ1（IL-29），IFN-λ2(IL-28A），IFN-λ3（IL-28B）和IFN-λ4。雖然其下游信號(hào)與Ⅰ型干擾素有較大的重疊性，但是在抗病毒感染過程中仍具有特異性。NK細(xì)胞是抗病毒感染的主要效應(yīng)細(xì)胞，Ⅲ型干擾素是否具有調(diào)控NK細(xì)胞的抗病毒功能報(bào)道較少，為此我們構(gòu)建了小鼠IL-2

9、8B過表達(dá)載體，通過高壓注射實(shí)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)持續(xù)性表達(dá)IL-28B，進(jìn)而研究其在NK細(xì)胞發(fā)育分化及發(fā)揮功能過程中的調(diào)控作用。結(jié)果如下:
　　1)首先，我們對(duì)高壓注射pLIVE-IL-28b或空載體pLIVE-vector的野生型小鼠脾臟、肝臟及肺臟NK細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IL-28B系統(tǒng)性地增加了NK細(xì)胞的比例和數(shù)目。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠NK細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，IL-28B過表達(dá)小鼠的脾臟、肝臟和肺臟NK細(xì)

10、胞的增殖能力均顯著提高。接著，我們根據(jù)NK細(xì)胞表面標(biāo)志CD11b，CD27以及KLRG1對(duì)NK細(xì)胞的成熟階段進(jìn)行劃分，并檢測(cè)不同成熟階段NK細(xì)胞的比例及增殖能力。結(jié)果表明，IL-28B過表達(dá)小鼠各臟器中終末成熟階段的NK細(xì)胞具有更高的增殖能力。這一部分結(jié)果表明，體內(nèi)過表達(dá)IL-28B促進(jìn)NK細(xì)胞增殖和成熟。
　　2)為了探索過表達(dá)IL-28B對(duì)NK細(xì)胞活化狀態(tài)和功能的影響，我們檢測(cè)了過表達(dá)IL-28B的小鼠脾臟、肝臟及肺臟中NK細(xì)

11、胞的表面受體NKG2A/C/E，NKG2D，Ly49CIFH、分泌型分子IFN-γ，perforin以及活化性標(biāo)志CD69的表達(dá)情況，與對(duì)照組小鼠相比均無顯著性差異，說明體內(nèi)過表達(dá)IL-28B不會(huì)引起NK細(xì)胞的過度活化和功能增強(qiáng)。
　　3)由于IL-28Rα只表達(dá)于有限類型的細(xì)胞上，NK細(xì)胞能否直接接受IL-28B的信號(hào)仍存在爭(zhēng)議。我們發(fā)現(xiàn)，在IL-28B過表達(dá)小鼠中肺臟NK細(xì)胞增加最為顯著，而肺泡巨噬細(xì)胞中IL-28Rα的表達(dá)水

12、平顯著高于NK細(xì)胞。為了研究IL-28B是否通過先作用于巨噬細(xì)胞進(jìn)而影響了NK細(xì)胞的增殖能力，我們對(duì)IL-28B過表達(dá)小鼠采用氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)小鼠脾臟、肝臟及肺臟中NK細(xì)胞的比例及不同發(fā)育階段進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞清除小鼠中，NK細(xì)胞比例顯著下降，不成熟階段NK細(xì)胞增多而成熟階段NK細(xì)胞減少。說明在小鼠體內(nèi)，巨噬細(xì)胞參與了IL-28B誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖和成熟的過程。
　　4)為了進(jìn)一步確定巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞

13、的相互作用，我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中用不同濃度的IL-28B對(duì)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激，進(jìn)而將巨噬細(xì)胞與CFSE標(biāo)記的小鼠肺臟NK細(xì)胞共孵育，并對(duì)NK細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，IL-28B預(yù)刺激的肺泡巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)NK細(xì)胞增殖的能力，并且具有劑量依賴性。為了研究IL-28B刺激的巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞之間的作用是否依賴細(xì)胞間直接接觸，transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞依然能夠顯著促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，說明IL-28B通過巨噬細(xì)胞促進(jìn)NK

14、細(xì)胞的增殖不依賴細(xì)胞間直接接觸。
　　5)最后，我們采用鼠肺適應(yīng)株流感病毒PR8對(duì)野生型小鼠進(jìn)行滴鼻感染，并檢測(cè)其肺臟IL-28的表達(dá)情況。結(jié)果表明，流感病毒感染小鼠的肺臟IL-28基因及蛋白水平的表達(dá)均顯著升高。在流感病毒PR8感染模型中，體內(nèi)過表達(dá)IL-28B組小鼠的生存率顯著提高，體重下降速率減緩，病理?yè)p傷情況明顯減輕，均提示IL-28B對(duì)PR8毒株的感染具有保護(hù)性作用。在NK細(xì)胞缺陷鼠Nfil3-/-小鼠中，過表達(dá)IL-2

15、8B對(duì)流感病毒感染具有一定的保護(hù)性作用，但是保護(hù)效果與野生型小鼠相比較差。說明當(dāng)NK細(xì)胞缺陷時(shí)，IL-28B的保護(hù)性功能受損，揭示NK細(xì)胞參與了IL-28B保護(hù)流感病毒感染小鼠的過程中。
　　以上結(jié)果表明，體內(nèi)過表達(dá)IL-28B可以系統(tǒng)性地促進(jìn)NK細(xì)胞增殖和成熟，而這一過程是巨噬細(xì)胞依賴的。在鼠肺適應(yīng)株流感病毒PR8滴鼻感染小鼠模型中，過表達(dá)IL-28B對(duì)小鼠具有保護(hù)性作用，一方面歸因子其自身抗病毒功能，另一方面則由于誘導(dǎo)產(chǎn)生更多