牛αsl-casein乳腺表達(dá)載體及金屬硫蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中的表達(dá).pdf

1、金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸、無(wú)芳香族氨基酸的低分子量蛋白，可分為四種亞型MT-Ⅲ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ、MT-Ⅳ，每分子MT可以結(jié)合7分子的Zn3+或Cd2+。對(duì)金屬離子與自由基具有很高親和力的特性使得MT在對(duì)金屬離子特別是Zn2+的代謝、運(yùn)輸以及自由基的清除過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，因此在商業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，但傳統(tǒng)制備方法效率低、成本高的局限性限制了MT的大規(guī)模應(yīng)用，因此我們借助乳腺生物反應(yīng)器技術(shù)以解決這種問(wèn)題。
　　

2、首先，利用牛αs1酪蛋白的兩側(cè)序列-1660-1437，15628-19476作為MT的調(diào)控元件，1.3kb雞溶菌酶基因5’側(cè)翼序列和2個(gè)拷貝的雞β珠蛋白絕緣子作為去除位置效應(yīng)的原件，三者通過(guò)組合得到三種結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體pIMC-MT、pIC-MT、pMC-MT。
　　 其次，采用限制性內(nèi)切酶切割三個(gè)表達(dá)載體，并將得到的包含結(jié)構(gòu)元件的片段通過(guò)原核顯微注射技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因鼠，在F0代鼠中經(jīng)PCR和SouthernBlot鑒定pIMC-

3、MT共有7只陽(yáng)性鼠(公鼠3、14、16、20,母鼠22、24、29)，pIC-MT共有7只陽(yáng)性鼠(公鼠2、7、8、10、13，母鼠21、27)，pMC-MT共有陽(yáng)性鼠3只(公鼠6、12，母鼠20)。由于母鼠少，所以對(duì)陽(yáng)性鼠傳代以擴(kuò)大陽(yáng)性母鼠數(shù)量。經(jīng)PCR鑒定F1代鼠中pIMC-MT共8只陽(yáng)性母鼠(8、10、11、20、22、23、36、44)，pIC-MT共3只陽(yáng)性母鼠(6、10、28)，pMC-MT共1只陽(yáng)性母鼠(25)。
　　

4、 最后，對(duì)F0代和F1代母鼠分別采集乳汁，并對(duì)F1代采集乳腺組織進(jìn)行Western blot、RT-PCR及Real-timePCR鑒定。在蛋白水平上所有轉(zhuǎn)基因鼠均未檢測(cè)到MT的表達(dá)，只在RNA水平上檢測(cè)到F1代小鼠中MT的表達(dá)，pIMC-MT轉(zhuǎn)基因鼠中只有11號(hào)有表達(dá)，pIC-MT及pMC-MT轉(zhuǎn)基因鼠中全部有表達(dá)。與GAPDH相比，GAPDH的表達(dá)量分別是pIMC-MT-F1-11的17.87、pIC-MT-F1-6的2.25、p