基于金屬納米材料的新型傳感技術(shù)研究.pdf

1、生物傳感器具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、選擇性好，一般不需要對樣品進行預處理，可實現(xiàn)連續(xù)在線檢測等優(yōu)點，它的出現(xiàn)和發(fā)展為生命科學研究提供了一種新的手段和技術(shù)支持，極大地推動生命科學研究的發(fā)展，也日益得到了科研工作者的重視。近年來新興的納米材料由于其具有獨特的物理、化學性質(zhì)而受到人們的廣泛關(guān)注。本研究論文將納米金、銀納米簇等納米材料與熒光和化學生物傳感技術(shù)的優(yōu)勢相結(jié)合，開發(fā)和建立了一些熒光和電化學檢測新方法用于多核苷酸激酶、微球菌酶、膽固醇等

2、與生命活動緊密相關(guān)的物質(zhì)的檢測，與傳統(tǒng)方法相比，本論文所建立的方法靈敏度高，選擇性好，具體研究內(nèi)容如下：
　?。?）基于λ外切酶對磷酸化DNA的降解以及利用鏈霉親和素-金納米粒子復合物和堿性磷酸酶對電化學信號的放大作用，提出了一種檢測多聚核苷酸激酶（PNK）活性的雙重信號放大的電化學方法（第2章）。當體系中存在PNK時，固定于電極表面的PNK底物探針的5'末端將會被磷酸化。當?shù)孜锾结樅团c之完全互補的生物素化的檢測探針雜交后，底物探

3、針將會被λ外切酶降解，使得檢測探針從電極表面解離下來，鏈霉親和素-金納米粒子和生物素化的堿性磷酸酶不能與之結(jié)合，從而引起電化學信號降低。當PNK的濃度在0.01U/mL至5U/mL范圍內(nèi)時，電化學信號與 PNK濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，其檢測限為0.01U/mL。同時，也對硫酸銨對PNK酶活性的抑制作用進行了研究。
　?。?）基于λ外切酶對磷酸化末端的特異性降解和DNA酶對底物DNA的切割及其循環(huán)作用，建立了一種檢測PNK酶活性的新方

4、法（第3章）。當體系中存在PNK時，C-DNA的5′羥基將會被磷酸化，與互補序列E-DNA雜交成雙鏈后將被λ外切酶識別并降解，使得E-DNA從雙鏈中得以釋放出來，在Mg2+的共同作用下，使得DNA酶被激活，識別并切割底物信標，使得信標分子上熒光基團的熒光信號得以恢復。同時，E-DNA將得以釋放，將與新的MB分子雜交，引發(fā)下一輪的催化切割，使得體系的熒光信號得到放大。在最佳實驗條件下，檢測PNK的線性范圍為0.5-100 U/mL，檢測限

5、為0.16 U/mL。該實驗方法為PNK酶活性檢測提供了一種新的方法。
　　（3）基于過氧化氫對銀納米簇熒光的猝滅，建立了一種新的檢測膽固醇含量的熒光方法（第4章）。首先在文獻報道的基礎(chǔ)上，對合成銀納米簇的DNA模板分子進行了優(yōu)化，實驗結(jié)果表明，當在原模板分子的3'末端加上1-2個G堿基時，熒光將顯著增強，其最大發(fā)射波長為605 nm。同時，首次發(fā)現(xiàn)過氧化氫的存在能顯著猝滅銀納米簇的熒光?；诖嗽?，用優(yōu)化后的模板合成的銀納米簇作

6、為熒光指示劑測定了膽固醇的含量。當膽固醇的濃度在0.2至200μM范圍內(nèi)時，熒光強度與膽固醇濃度的對數(shù)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)為R=0.9943，檢測限為0.15μM，該方法操作簡單，靈敏，并具有良好的選擇性，該方法也有望用于其他的在氧化過程中能產(chǎn)生過氧化氫的物質(zhì)的檢測。
　?。?）基于微球菌酶（MNase）對銀納米簇模板DNA的降解，建立了一種新的高靈敏，高選擇性的非標記的熒光方法用于檢測MNase活性（第5章）。實

7、驗中所用的單鏈DNA為MNase的底物，同時也是合成銀納米簇的模板。當體系中存在MNase時，單鏈DNA將被降解，從而合成的AgNCs的量隨之減少，得到降低的熒光信號。當MNase的濃度在1×10-5 U/mL至2×10-4 U/mL的范圍內(nèi)時，AgNCs熒光強度與MNase濃度呈線性相關(guān)，檢測限為8×10-6 U/mL。該方法在均相中進行，無需對DNA鏈進行標記或者修飾，無需分離，簡單，靈敏，快速，選擇性高，同時該方法也可用于其它酶的

8、檢測。
　?。?）基于聚合酶延伸和借助鏈霉親和素-金納米粒子（SA-AuNPs）復合物和堿性磷酸酶實現(xiàn)的兩步信號放大作用，提出了一種測定microRNA(miRNA)的電化學新方法（第6章）。目標miRNA與固定于電極表面的DNA模板雜交，在DNA聚合酶和dNTPs的存在下，miRNA作為引物將沿著DNA模板進行延伸。在延伸的過程中，由于biotin-11-dUTP的使用，生物素基團將被引入延伸產(chǎn)物當中。因此，利用SA-AuNPs

9、的橋梁作用，生物素化的堿性磷酸酶（biotin-ALP）將與延伸產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，產(chǎn)生電化學信號。當目標miRNA的濃度在1 pM到10 nM范圍內(nèi)時，電化學信號與miRNA的濃度的對數(shù)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其檢測限為0.9 pM。該方法具有很高的選擇性，當目標RNA與其他RNA只存在一個堿基的差別時，該傳感裝置亦能對其進行區(qū)分。正是由于該傳感器所具有的優(yōu)異性能，使得該裝置作為一種重要的檢測 RNA的方法用于生物醫(yī)學研究和醫(yī)療診斷等領(lǐng)

10、域。
　?。?）基于磁性納米粒子良好的分離富集作用和SYBR Green I嵌入雙鏈DNA后熒光增強的性質(zhì)，建立了一種新的測定生物素的熒光方法（第7章）。體系中的生物素與生物素修飾的DNA競爭與磁性納米粒子上的鏈霉親和素結(jié)合。經(jīng)磁性分離后，未結(jié)合的雙鏈DNA將被洗去，隨后加入的SYBR Green I染料將嵌入被磁性納米粒子捕獲的雙鏈DNA中，產(chǎn)生熒光信號。在最佳實驗條件下，分析體系在532 nm處的熒光發(fā)射強度隨著生物素濃度的增