ZIP1蛋白對(duì)酒精誘導(dǎo)的兔BMSCs成脂基因PPARγ、aP2的影響研究.pdf

1、目的：
　　酒精性股骨頭壞死是因?yàn)殚L(zhǎng)期大量酗酒而引起的一種非創(chuàng)傷性的股骨頭壞死，是以中青年男性患者居多的骨科常見疾病。脂質(zhì)紊亂及脂肪分化異常是導(dǎo)致酒精性股骨頭壞死的重要機(jī)制，鋅鐵調(diào)控蛋白1（ZIP1）作為鋅離子的轉(zhuǎn)運(yùn)體，能將鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，但ZIP1蛋白是否能通過影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化，從而抑制脂肪細(xì)胞的形成尚不明確，本實(shí)驗(yàn)將探討ZIP1蛋白對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響，從而為酒精性股骨

2、頭壞死的防治提供思路。
　　方法：
　　1、取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，再用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)后獲得狀態(tài)良好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行油紅“O”染色，分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化能力；設(shè)計(jì)合成ZIP1siRNA1、2、3三條序列，并兔轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞， RT-PCR檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ZIP1mRNA表達(dá)量，篩選ZIP1siRNA最佳序列；同時(shí)設(shè)計(jì)合成ZIP1目的片段，構(gòu)建ZIP1表達(dá)載

3、體，予FD KpnI和FD EcoR限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙切驗(yàn)證和重組載體測(cè)序,將成功構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、先將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分為9組，即正常對(duì)照組、模型組（0.03mol/L酒精組、0.09mol/L酒精組、0.15 mol/L酒精組、0.21mol/L酒精組）、實(shí)驗(yàn)組（0.03mol/L酒精+ZIP1siRNA組、0.09mol/L酒精+ZIP1siRNA組、0.15mol/L酒精+ZIP1siRNA組

4、、0.21mol/L酒精+ZIP1siRNA組）。正常對(duì)照組不做任何處理正常培養(yǎng)，模型組分別用含有0.03mol/L、0.09mol/L、0.15mol/L、0.21mol/L酒精濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組予轉(zhuǎn)染 ZIP1siRNA序列后分別用含有0.03mol/L、0.09mol/L、0.15mol/L、0.21mol/L酒精濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每組均培養(yǎng)6h。采用試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量，記錄甘油三酯含量變化， West

5、ern blotting分別檢測(cè)各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中PPARγ， aP2蛋白表達(dá)的含量。
　　3、將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分為3組，正常對(duì)照組、ZIP1表達(dá)組、ZIP1siRNA組。正常對(duì)照組未經(jīng)任何處理正常培養(yǎng)，表達(dá)轉(zhuǎn)染組予ZIP1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后正常培養(yǎng)，ZIP1siRNA轉(zhuǎn)染組予ZIP1siRNA序列轉(zhuǎn)染后正常培養(yǎng)，每組均培養(yǎng)6h。采用Western blotting方法分別檢測(cè)各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中PPARγ，aP2蛋白表達(dá)的含

6、量。
　　結(jié)果：
　　1、在濃度為siRNA25nM情況下ZIP1 siRNA序列1、2、3組與ZIP1 siRNA空轉(zhuǎn)染序列組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹤0.05），但ZIP1siRNA序列2組ZIP1mRNA表達(dá)含量明顯升高；ZIP1siRNA序列1、3組ZIP1mRNA表達(dá)含量明顯降低，相比較ZIP1siRNA序列3組ZIP1mRNA表達(dá)含量更低。ZIP1表達(dá)載體經(jīng)FD KpnI和FD EcoRI雙酶切和測(cè)序鑒定后，

7、目的片段和重組載體插入片段完全一致重組載體構(gòu)建成功。
　　2、0.03mol/L酒精組、0.09mol/L酒精組、0.15mol/L酒精組、0.21mol/L酒精組中aP2、PPARγ蛋白表達(dá)量明顯升高，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；甘油三酯含量在0.03mol/L酒精組與正常對(duì)照組比較時(shí)無(wú)明顯升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹥0.05）外，其他組與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），其中0.21mol/L

8、酒精組aP2、PPARγ蛋白表達(dá)量及甘油三酯含量最高，與其他組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；而在同一濃度為0.21 mol/L酒精培養(yǎng)下，0.21mol/L酒精+ZIP1siRNA組aP2、PPARγ蛋白表達(dá)含量及甘油三酯含量較0.21mol/L酒精組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。
　　3、ZIP1表達(dá)組aP2、PPARγ蛋白表達(dá)含量明顯降低，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），ZIP1si

9、RNA組aP2、PPARγ蛋白表達(dá)含量明顯升高，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、成功合成并篩選ZIP1siRNA序列3為最佳抑制序列，能夠明顯抑制ZIP1mRNA的表達(dá)，成功構(gòu)建了表達(dá)ZIP1基因的載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確。
　　2、酒精能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化，在一定范圍內(nèi)隨著酒精濃度增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的能力增強(qiáng)，并且在酒精作用下ZIPsiRNA能促進(jìn)骨髓間