MicroRNA靶向Id1對(duì)BMSCs成骨分化的影響.pdf

1、背景：
　　骨形成蛋白2(Bone morphogenetic protein，BMP2)基因可促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)的成骨分化，但在成骨分化的終末期該基因可引起B(yǎng)MSCs成骨指標(biāo)不佳。Id1因子在BMSCs成骨分化過程中的表達(dá)變化，是BMSCs成骨分化的關(guān)鍵。BMP2上調(diào)Id1因子的表達(dá)，提示Id1因子可能是BMP2高表達(dá)環(huán)境中BMSCs成骨分化的關(guān)鍵因子。通過miR

2、NA芯片篩選發(fā)現(xiàn)某些miRNA表達(dá)水平在BMP2刺激和未刺激的BMSCs中存在顯著差異，并且這些miRNA與通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的可能調(diào)控Id1因子表達(dá)的miRNA相符合。
　　目的：
　　闡述體外高表達(dá)BMP2及Id1因子的變化對(duì)大鼠BMSCs成骨分化的影響，驗(yàn)證Id1因子在BMP2修飾的BMSCs成骨分化中的重要作用，證明Id表達(dá)上調(diào)是BMP2抑制BMSCs成骨分化的原因并探尋BMP2對(duì)Id1的調(diào)控機(jī)制;擬篩選鑒定出靶向作

3、用于Id1因子的miRNA分子，證明某些特定的miRNA表達(dá)變化可能是BMP2上調(diào)Id1表達(dá)的新分子機(jī)制，為頜面部骨缺損修復(fù)提供新的研究策略。
　　方法：
　　1、分離及純化培養(yǎng)Wistar大鼠的BMSCs，分別于不同時(shí)間點(diǎn)，顯微鏡下觀察BMSCs的形態(tài);取第3-5代BMSCs，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，培養(yǎng)7-14天，進(jìn)行茜素紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察礦化情況，進(jìn)行成骨鑒定;取第3-5代BMSCs，進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，培養(yǎng)7-14天，進(jìn)行油紅

4、0染色，光學(xué)顯微鏡觀察著色脂滴，進(jìn)行成脂鑒定。
　　2、根據(jù)Genbank中Id1的mRNA序列設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增基因片段并鑒定PCR產(chǎn)物;對(duì)已構(gòu)建的pDC316-BMP2-GFP重組腺病毒，進(jìn)行滴度測(cè)定;腺病毒Ad-BMP2、Ad-GFP轉(zhuǎn)染第2-3代BMSCs，病毒轉(zhuǎn)染后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)病毒對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響;取MOI值為40時(shí)，腺病毒Ad-BMP2、Ad-GFP轉(zhuǎn)染第2-3代BMSCs，分別于不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞

5、(Ad-BMP2-BMSCs組、Ad GFP-BMSCs組、BMSCs組)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中目的基因Id1的表達(dá)。
　　3、篩選靶向Id1基因的miRNA，應(yīng)用miRNA在線數(shù)據(jù)庫(kù)，針對(duì)Id1因子預(yù)測(cè)可能調(diào)控其表達(dá)的miRNA分子，根據(jù)評(píng)分結(jié)果加以選擇，通過miRNA表達(dá)譜芯片及相關(guān)技術(shù)篩選，將芯片篩選和預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行分析，提取細(xì)胞的RNA，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)驗(yàn)證miRNA的變化與芯片檢測(cè)結(jié)果的一致性，

6、篩選從而明確研究的miRNA。
　　結(jié)果：
　　1、成骨誘導(dǎo)的BMSCs生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)多角形成骨細(xì)胞形態(tài);誘導(dǎo)7天后，茜素紅染色可觀察到少量點(diǎn)狀紅色礦化結(jié)節(jié)的形成，誘導(dǎo)14天可觀察到明顯的礦化結(jié)節(jié)。
　　2、脂肪誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs，誘導(dǎo)后的細(xì)胞增殖稍緩慢，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)展平;誘導(dǎo)14天后油紅0染色可觀察到脂滴形成。
　　3、Ad-BMP2轉(zhuǎn)染BMSCs48h后，熒光顯微鏡現(xiàn)觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白

7、表達(dá)的情況，細(xì)胞表達(dá)綠色熒光比例隨MOI值的增加而增高，當(dāng)MOI值為40時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察有95％以上的細(xì)胞出現(xiàn)了綠色熒光。
　　4、腺病毒轉(zhuǎn)染后沒有影響細(xì)胞的增殖，各組增殖數(shù)目間無顯著差異（P＞0.056）。
　　5、通過miRNA表達(dá)譜芯片及相關(guān)技術(shù)篩選其差異情況發(fā)現(xiàn)有123個(gè)miRNA下調(diào)，114個(gè)miRNA上調(diào);將芯片篩選和預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一共有3個(gè)miRNA發(fā)生變化，miRNA-338、miRNA-19

8、5及miRNA-98;其中1個(gè)上調(diào)，2個(gè)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1、密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，此方法可得到純度較好的BMSCs，BMSCs具有成骨分化能力和成脂肪分化能力。
　　2、Ad-BMP2重組腺病毒表達(dá)載體，滴度高轉(zhuǎn)染效率好，為穩(wěn)定且有效的基因表達(dá)載體，病毒轉(zhuǎn)染后可使BMSCs過表達(dá)BMP2，最佳MOI值為40。
　　3、在靶向Id1的miRNA分子中，生物預(yù)測(cè)結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致的是:mi