擬南芥網(wǎng)格蛋白及其接頭蛋白AP2和TPC質(zhì)膜招募調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的膜蛋白內(nèi)吞途徑(Clathrin-mediated endocytosis;CME)是真核細(xì)胞質(zhì)膜蛋白進(jìn)行內(nèi)吞的主要途徑之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收、胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸和逆境響應(yīng)中具有不可或缺的生物學(xué)功能。已知植物網(wǎng)格蛋白質(zhì)膜招募依賴于接頭蛋白復(fù)合體AP2(Adaptor protein2)和TPC(TPLATE complex)，其中AP2是由α、β、μ和σ組成的異源四聚體，而TPC是由TPLATE、TML

2、、TASH3、LOLITA、TWD40-1、TWD40-2、AtEH1和AtEH2組成的八聚體。已有研究表明，植物激素生長(zhǎng)素(Auxin)、水楊酸(SA;salicylic acid)和CME人工合成抑制劑TyrA23能快速抑制質(zhì)膜蛋白內(nèi)吞，包括生長(zhǎng)素極性輸出載體PIN和水通道蛋白PIP2A等質(zhì)膜蛋白的內(nèi)吞。然而，這些CME抑制劑是否通過(guò)調(diào)控網(wǎng)格蛋白、AP2和TPC的質(zhì)膜招募來(lái)快速調(diào)控質(zhì)膜蛋白內(nèi)吞目前仍不清楚。
　　前期研究表明，

3、外源生長(zhǎng)素處理差異調(diào)控網(wǎng)格蛋白輕鏈CLC和重鏈CHC的質(zhì)膜招募，暗示生長(zhǎng)素通過(guò)調(diào)控網(wǎng)格蛋白質(zhì)膜招募來(lái)調(diào)控質(zhì)膜蛋白內(nèi)吞。本研究利用熒光免疫定位和活細(xì)胞成像技術(shù)，結(jié)合遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)等研究方法，初步剖析了生長(zhǎng)素、SA和TyrA23對(duì)網(wǎng)格蛋白、AP2和TPC質(zhì)膜招募的影響。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)與生長(zhǎng)素處理相似，TyrA23（A23;30μM）和SA(25μM)差異調(diào)控CLC和CHC的質(zhì)膜招募。A23處理5-30min

4、快速抑制CLC質(zhì)膜招募，但促進(jìn)CHC質(zhì)膜招募。相反，A23處理120min抑制CHC質(zhì)膜招募，而CLC質(zhì)膜招募恢復(fù)正常水平。SA短時(shí)間處理與生長(zhǎng)素、A23的處理效果相似，但不同的是，SA處理4h后，才能觀察到CLC招募恢復(fù)和CHC招募抑制。這些分析結(jié)果至少說(shuō)明A23和SA通過(guò)快速調(diào)控CLC質(zhì)膜招募來(lái)調(diào)控CHC質(zhì)膜招募和CME。
　　(2)SA和A23短時(shí)間處理(30min)抑制AP2亞基AP1/2β1和AP2σ質(zhì)膜招募，但沒(méi)有影響

5、AP2α和AP2μ質(zhì)膜招募。A23長(zhǎng)時(shí)間處理(120min)均顯著抑制了AP2四個(gè)亞基的質(zhì)膜招募，相反，SA長(zhǎng)時(shí)間處理與短時(shí)間處理效果相似。人工合成生長(zhǎng)素2，4-D(10μM)短時(shí)間處理和長(zhǎng)時(shí)間處理均不影響AP2各個(gè)亞基的質(zhì)膜招募。
　　(3)生長(zhǎng)素、SA和A23短時(shí)間處理(30min)均不影響TPC亞基的質(zhì)膜，表明生長(zhǎng)素、SA和A23調(diào)控CLC質(zhì)膜招募不是通過(guò)調(diào)控TPC功能來(lái)現(xiàn)實(shí)的。然而，在A23存在的情況下，TPC功能缺陷抑制

6、了CLC質(zhì)膜招募的恢復(fù)，表明在AP2缺乏的情況下，TPC是網(wǎng)格蛋白質(zhì)膜招募所必需的。
　　(4)AP2σ和AP2μ功能缺失顯著抑制了PIN2-GFP內(nèi)吞。SA和A23未能有效抑制ap2σ突變體PIN2-GFP內(nèi)吞;相反，SA和A23仍能有效抑制ap2μ突變體PIN2-GFP內(nèi)吞。另外，生長(zhǎng)素均能有效抑制ap2σ和ap2μ突變體PIN2-GFP內(nèi)吞。這些分析結(jié)果暗示，AP2σ可能是SA和A23調(diào)控AP2功能的重要作用位點(diǎn)。