木聚糖酶的固定化、低聚木糖的制備及其功效研究.pdf

1、目的：建立固定化木聚糖酶的制備方法，提高木聚糖酶YS1069的穩(wěn)定性、重復(fù)利用率；建立固定化木聚糖酶制備低聚木糖的方法；開(kāi)展低聚木糖的功效研究；為應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：（1）將交聯(lián)酶聚集體CLEAs技術(shù)與載體固定化技術(shù)相結(jié)合，篩選合適的樹(shù)脂對(duì)木聚糖酶進(jìn)行固定化，采用單因素法和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)固載化木糖聚酶CLEAs的制備條件進(jìn)行優(yōu)化。（2）研究對(duì)比固載化木糖聚酶CLEAs和游離酶的酶學(xué)性質(zhì)。（3）利用固載化木聚糖酶CLEAs制備低

2、聚木糖，采用單因素法和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)制備條件進(jìn)行優(yōu)化，高效液相法分析低聚木糖的成分。（4）復(fù)制氧化型低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）氧化損傷模型，研究低聚木糖的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分五組：正常對(duì)照組、ox-LDL模型組、低聚木糖組（5，10，20mg/mL）；酶

3、化學(xué)方法檢測(cè)各組中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性。
　　結(jié)果：（1）固載化木聚糖酶CLEAs的最佳制備條件：LKZ-218樹(shù)脂為載體，酶液的pH為9.0，沉淀劑為2mL的異丙醇，沉淀時(shí)間為1h，交聯(lián)劑的濃度為1.59g/L，交聯(lián)時(shí)間為2h，固定化時(shí)間為9.25h，固定化溫度為20℃，加酶量為8mg，此條件下制備的固載化木聚糖酶CLEAs的回收率達(dá)到65.63％，并且載酶量最高達(dá)到190U/g。（

4、2）通過(guò)研究其酶學(xué)性質(zhì)得出固載化木聚糖酶CLEAs的最適作用溫度比游離酶高10℃，達(dá)到65℃；最適作用pH沒(méi)有改變；pH穩(wěn)定性和耐熱性均得到提高；固載化木聚糖酶CLEAs在重復(fù)使用10次后，其相對(duì)酶活仍為42.3%；儲(chǔ)存12周后游離酶的相對(duì)酶活為12%，而固載化木聚糖酶CLEAs的相對(duì)酶活仍為47%；固載化木聚糖酶CLEAs在有機(jī)試劑、表面活性劑和金屬離子溶液中處理一段時(shí)間后酶活損失比游離酶少，穩(wěn)定性顯著提高；研究酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)得出

5、：固載化木聚糖酶CLEAs的Km為9.6 g/L，Vmax為4.0 mmol/L/min；游離酶的Km為9.1 g/L，Vmax為6.2 mmol/L/min。（3）固載化木聚糖酶CLEAs制備低聚木糖的最佳條件為：底物的濃度52.5g/L，酶解時(shí)間3h，酶解溫度57℃，pH9，加酶量0.2g/g。HPLC分析低聚木糖的組分得出酶解產(chǎn)物中包括木糖、木二糖、木三糖等低聚木糖，并且木二糖的含量最多。（4）酶化學(xué)方法檢測(cè)低聚木糖的抗氧化活性表

6、明：與正常組相比，模型組中GSH-PX、SOD活性明顯降低；而預(yù)先給予不同濃度低聚木糖預(yù)處理后，GSH-PX、SOD的活性隨著劑量的增加而增大（與模型組相比，P<0.05）。
　　結(jié)論：將交聯(lián)酶聚集體CLEAs技術(shù)與載體固定化技術(shù)相結(jié)合制備的固載化木聚糖酶CLEAs回收率達(dá)到65.63%，載酶量達(dá)到190U/g。木聚糖酶經(jīng)過(guò)固定化之后其穩(wěn)定性顯著提高。利用固載化木聚糖酶CLEAs制備的低聚木糖主要成分為木二糖，并且具有一定的抗氧化