熱休克蛋白Sse1的表達(dá)純化以及生化性質(zhì)研究.pdf

1、熱休克蛋白作為分子伴侶，是在細(xì)菌到哺乳動(dòng)物中廣泛存在的一類高度保守的蛋白質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的折疊，組裝以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并且能夠防止蛋白質(zhì)的變性、凝聚以及促進(jìn)變性蛋白的分解代謝。熱休克蛋白110(Heat shock proteins110，Hsp110)作為Hsp70(Heat shock proteins70，Hsp70)的同源蛋白，是一類在真核生物中豐富表達(dá)的蛋白質(zhì)，能在哺乳動(dòng)物組織尤其是哺乳動(dòng)物大腦中高度表達(dá)。作為Hsp70蛋白功能所必

2、需的核苷酸交換因子(Nucleotide Exchange Factor，NEFs)，Hsp110在防止變性蛋白凝聚方面顯示出了較Hsp70更高的活性，然而其并不具備類似Hsp70的促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的活性，因此Hsp70被稱為折疊酶(foldase)，而Hsp110被稱為持家酶(holdase)。
　　Hsp110在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中有Sse1(Yeast Stress SeventyPr

3、otein1)和Sse2（Yeast Stress Seventy Protein2）兩種主要形式，其中Sse1是酵母在正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)的主導(dǎo)蛋白，而在諸如熱激等條件下，Sse1被進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)的同時(shí)，Sse2也會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)Sse1也具備加快Hsp70核苷酸交換速度的作用。Sse1最先作為鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白從釀酒酵母中分離出來(lái)，其晶體結(jié)構(gòu)已得到解析，因此Sse1常被用作研究Hsp110的模型。
　　為了研究Sse1底物結(jié)合結(jié)

4、構(gòu)域的主要功能位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)Sse1與Hsp70的結(jié)構(gòu)同源性，首先在野生型Sse1的主要功能區(qū)域(底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Substrate BindingDomain，SBD)進(jìn)行了8個(gè)位點(diǎn)的突變:Sse1-loop12，Sse1-loop23，Sse1-loop34，Sse1-loop45，Sse1-loop56，Sse1-loop67，Sse1-loop78，Sse1-G466PG472P，通過(guò)DNA測(cè)序鑒定正確后，對(duì)其進(jìn)行表達(dá)純化。

5、然后通過(guò)熒光偏振技術(shù)對(duì)突變型Sse1和野生型Sse1的底物結(jié)合能力進(jìn)行了比較。進(jìn)而通過(guò)酵母體內(nèi)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，從酵母生長(zhǎng)表型上探究不同Sse1突變體對(duì)酵母表型的影響。最后通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)酵母中Sse1的表達(dá)情況，以探究這些突變對(duì)酵母表型的影響是否源自蛋白功能的喪失。
　　實(shí)驗(yàn)表明，相較于野生型Sse1，Sse1-loop12和Sse1-loop78的底物親和性無(wú)明顯變化，且其表型也與野生型相一致，只有Sse1-loop45雖然