曲霉CJ22-326產(chǎn)殼聚糖酶基因的克隆、表達(dá)與定點(diǎn)突變.pdf

1、殼聚糖酶可以專一性地水解殼聚糖，生成在很多領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用的低聚殼聚糖。但是已報(bào)道的微生物產(chǎn)殼聚糖酶的酶活力普遍較低。本實(shí)驗(yàn)室從大海淤泥中成功篩選到了一株產(chǎn)殼聚糖酶菌株曲霉CJ22-326。此菌株可以在殼聚糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中產(chǎn)內(nèi)切殼聚糖酶(CSN)和外切殼聚糖酶(CSX)。為了進(jìn)一步提高殼聚糖酶的活力，本研究運(yùn)用分子生物學(xué)的方法，對(duì)酶的基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)并對(duì)重組酶進(jìn)行了定點(diǎn)突變研究。
　　 本論文首先對(duì)CJ22-326進(jìn)行了菌種

2、的分子生物學(xué)鑒定。使用真菌通用引物NS1和NS8，以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到了曲霉的18s rDNA序列。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CJ22-326與曲霉屬的Aspergillus niger，Aspergillus proliferans，以及青霉屬的Penicillium expansum和Penicillium chrysogenum KCTC6052等菌株的相似性均達(dá)到了96%。但是根據(jù)孢子形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)它不

3、屬于其中任何的菌種，我們認(rèn)為它是曲霉屬的新菌種。
　　 利用3’-RACE(rapid amplification of cDNA ends)和5’-RACE的方法，使用簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增得到了編碼曲霉CJ22-326內(nèi)切殼聚糖酶的cDNA，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物，成功擴(kuò)增到了編碼曲霉CJ22-326內(nèi)切殼聚糖酶cDNA的結(jié)構(gòu)基因(717 bp)，此基因序列已在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)申請(qǐng)登記，登記號(hào)為EU30

4、2818。為了獲得曲霉CJ22-326外切殼聚糖酶的編碼序列，利用RT-PCR的方法，擴(kuò)增得到了編碼外切殼聚糖水解酶的cDNA。根據(jù)cDNA序列分析結(jié)果，進(jìn)一步擴(kuò)增出了來(lái)源于曲霉CJ22-326的外切殼聚糖水解酶的編碼序列(2652 bp)。該序列已在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)申請(qǐng)登記，登記號(hào)為FJ449570。
　　 將內(nèi)切殼聚糖酶和外切殼聚糖酶的cDNA結(jié)構(gòu)基因分別插入到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET2

5、8a-CSN和pET28a-CSX。將重組載體pET28a-CSN轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，重組菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出有活性的重組內(nèi)切酶，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)和Western-blot鑒定，重組大腸桿菌有分子量約為29 kDa的蛋白表達(dá)帶。采用不同的溫度和IPTG誘導(dǎo)濃度，對(duì)重組內(nèi)切酶的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為37℃，IPTG誘導(dǎo)濃度為1 mM時(shí)，蛋白質(zhì)的表達(dá)量最高。重組質(zhì)粒pET28a-CSX轉(zhuǎn)化大腸桿

6、菌BL21(DE3)pLysS中之后，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出有活性的重組外切酶，SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)到約100 kDa的蛋白表達(dá)帶。使用Ni-NTA親和層析對(duì)重組內(nèi)切酶和重組外切酶進(jìn)行了親和純化，分別得到了2.3 mg/L和1.2 mg/L蛋白質(zhì)。使用DNS法對(duì)重組內(nèi)切酶和重組外切酶的酶活力進(jìn)行了測(cè)定，分別為1.18 U/mL和6.96 U/mL。
　　 通過(guò)測(cè)定酶解液體系的粘度和對(duì)酶解產(chǎn)物的薄層層析分

7、析，發(fā)現(xiàn)重組酶CSN以內(nèi)切的方式水解殼聚糖的β-(1，4)糖苷鍵。而重組酶CSX是以外切的方式作用于殼聚糖的分子一端，依次切下氨基葡萄糖殘基。對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：重組內(nèi)切酶的最適pH值是6，最適反應(yīng)溫度是65℃，Km和Vmax分別為0.826 mg/ml和0.094mg/ml-min；重組外切酶的最適pH值是4.1，最適反應(yīng)溫度是50℃，Km和Vmax分別為0.146 mg/ml·min和7.758 mg/ml。重組內(nèi)

8、切酶和重組外切酶具有高度的底物專一性，除了對(duì)不同脫乙酰度的殼聚糖有作用以外，對(duì)幾丁質(zhì)和CMC沒(méi)有水解活力。兩者的反應(yīng)速率均隨著底物脫乙?；鹊奶岣叨黾?。
　　 運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法，對(duì)保守的谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)進(jìn)行定點(diǎn)突變后，發(fā)現(xiàn)Glu169和Asp160在突變后完全喪失了內(nèi)切殼聚糖酶的活力。使用圓二色譜對(duì)野生酶與突變酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)E169Q的結(jié)構(gòu)和野生酶以及其它保持一定活力的突變酶(D160E)基本保持一致