發(fā)菜胞外多糖化學(xué)修飾及免疫活性研究.pdf

1、發(fā)菜（Nostoc flagelliforme）是一種生長在干旱或半干旱條件下的陸生藍(lán)藻。目前，發(fā)菜細(xì)胞高密度液體培養(yǎng)技術(shù)逐漸成熟。發(fā)菜細(xì)胞在液體培養(yǎng)的過程中會向培養(yǎng)液中分泌胞外多糖，研究發(fā)現(xiàn)這種多糖具有很多生物活性，如增強免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等。但是，對這種多糖進行分子修飾的研究還未見報道。本課題以液體培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞的培養(yǎng)液為材料，對發(fā)菜胞外多糖進行提取純化，然后采用化學(xué)合成的方法對純化后的發(fā)菜胞外多糖進行硫酸化修飾和硒化修飾，研

2、究分子修飾前后多糖的體內(nèi)免疫活性和體外免疫活性。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用抗生素法對發(fā)菜細(xì)胞進行純化，排除雜菌對試驗的影響。對純化后的發(fā)菜細(xì)胞進行擴培，以培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞的培養(yǎng)液為材料提取發(fā)菜胞外多糖，并通過DEAE-52纖維素柱層析和凝膠柱層析對粗多糖進行純化。紫外光譜掃描純化后的發(fā)菜胞外多糖發(fā)現(xiàn)在260nm、280nm及520nm均沒有明顯的吸收峰，說明多糖中蛋白質(zhì)的含量很少，且不含核酸和色素等雜質(zhì)。⑵采用氯磺酸-吡啶法對發(fā)

3、菜胞外多糖進行硫酸化修飾，在單因素試驗的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度71℃，反應(yīng)時間3h，氯磺酸-吡啶的體積比為1:7。在這個條件下，取代度的值是5.05±0.032(N=3)。對分離純化的發(fā)菜胞外多糖和經(jīng)硫酸化修飾的發(fā)菜胞外多糖分別進行紅外光譜檢測，硫酸酯化的多糖在1165cm-1和834cm-1處有兩個新的強烈的吸收峰分別代表不對稱的S=O和對稱振動的C-O-S鍵，表明硫酸根基團已經(jīng)與多糖分子結(jié)合。⑶采用亞硒酸鈉法

4、對發(fā)菜胞外多糖進行硒化修飾，在單因素試驗的基礎(chǔ)上通過正交試驗設(shè)計得到最佳反應(yīng)條件：發(fā)菜胞外多糖20mg，亞硒酸鈉20mg、氯化鋇20mg、反應(yīng)溫度70℃、反應(yīng)時間10h，在此條件下，得到的硒化發(fā)菜胞外多糖中硒的含量達到1.45mg/g，產(chǎn)率為64.20％。紅外光譜分析表明硒化多糖在875cm-1有一個弱的吸收峰，是亞硒酸酯的特征吸收峰，說明亞硒酸根已經(jīng)和多糖結(jié)合。⑷研究硫酸化和硒化發(fā)菜胞外多糖對體內(nèi)免疫活性的影響，結(jié)果表明多糖、硫酸化多

5、糖和硒化多糖在一定濃度范圍內(nèi)均能提高小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)；顯著提高小鼠碳粒廓清指數(shù)；增加小鼠的足趾厚度；提高小鼠抗體細(xì)胞的生成數(shù)及血清溶血素的含量，且呈現(xiàn)劑量關(guān)系，其中硫酸化修飾多糖的作用效果最顯著，說明對發(fā)菜多糖進行硫酸化修飾是提高多糖免疫活性的有效方法。⑸研究硫酸化和硒化發(fā)菜胞外多糖對體外免疫活性的影響，結(jié)果表明多糖、硫酸化多糖和硒化多糖的濃度從25μg/mL增加至100μg/mL時，脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)逐漸增加、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬