SPIO對(duì)兩種干細(xì)胞生物學(xué)特性影響及利用磁靶向技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞遷移的初探.pdf

1、背景和目的：齲病和牙周病是臨床常見疾病、多發(fā)病，往往造成牙髓壞死和牙槽骨吸收以致牙齒缺失?，F(xiàn)有的診療技術(shù)往往無法真正意義上實(shí)現(xiàn)牙髓、牙周組織的生理性和功能性再生。因此，在當(dāng)代口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，牙髓和牙周組織再生治療仍然是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，外源性干細(xì)胞植入和自體干細(xì)胞歸巢療法在許多組織器官再生的實(shí)驗(yàn)研究中已經(jīng)被廣泛開展。然而，由于牙齒解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，學(xué)者們往往難以將干細(xì)胞有效的遷移并富集在牙髓或者牙周組織，同時(shí)在

2、進(jìn)行干細(xì)胞治療過程中也無法對(duì)植入的干細(xì)胞進(jìn)行示蹤觀察，這些都對(duì)牙髓和牙周組織原位再生帶來了極大的挑戰(zhàn)。
　　近年來出現(xiàn)的磁靶向技術(shù)可以極大的促進(jìn)植入的干細(xì)胞在靶器官的遷移和定植，同時(shí)與之相輔相成的臨床MRI檢測(cè)手段還可以對(duì)植入細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)的示蹤觀察，這些都為學(xué)者進(jìn)行牙髓和牙周組織再生指明了新的研究方向。在本試驗(yàn)中，我們首先選擇了一種新的自帶熒光且無需轉(zhuǎn)染劑的 SPIO（MIRB）對(duì)人牙髓干細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，探討了對(duì)其活力、增殖、分化

3、等一系列生物學(xué)影響，進(jìn)一步通過MRI技術(shù)對(duì)裸鼠皮下植入的細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)示蹤觀察。接下來我們用SPIO標(biāo)記了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外磁場(chǎng)環(huán)境下誘導(dǎo)細(xì)胞遷移，同時(shí)構(gòu)建大鼠牙槽骨缺損模型，從靜脈注射以及局部注射兩種細(xì)胞輸入途徑進(jìn)行研究，觀察體內(nèi)環(huán)境下磁靶向技術(shù)在促進(jìn)干細(xì)胞在牙槽骨缺損處的遷移和定植。本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了MRI活體示蹤觀察植入的干細(xì)胞，還豐富了磁靶向技術(shù)在牙周組織再生中的運(yùn)用，為未來牙周再生干細(xì)胞療法提供了新思路。結(jié)果如下：
　

4、　第一部分 MIRB標(biāo)記對(duì)hDPSCs的生物學(xué)影響以及體內(nèi)體外MRI成像
　　1.人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）培養(yǎng)和鑒定。本研究采用酶消化法/組織塊法從成人第三磨牙牙髓組織中分離培養(yǎng)人DPSCs，利用單細(xì)胞克隆法純化細(xì)胞，通過體外成骨、成脂誘導(dǎo)分化以及流式細(xì)胞儀鑒定確定了其干細(xì)胞屬性。
　　2. MIRB標(biāo)記hDPSCs。分別用終濃度為12.5，25，50，100μg Fe/mL的SPIO（MIRB?）標(biāo)記hDPSCs，利用

5、激光共聚焦、普魯士藍(lán)染色光鏡觀察以及透射電鏡等手段觀察了SPIO納米顆粒在 hDPSCs細(xì)胞內(nèi)的分布情況，分光光度計(jì)測(cè)量了各組細(xì)胞內(nèi)鐵含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， MIRB可以不需要轉(zhuǎn)染劑即可高效的標(biāo)記hDPSCs，各種濃度標(biāo)記后對(duì)細(xì)胞的形態(tài)沒有影響，且隨著標(biāo)記濃度的升高細(xì)胞內(nèi)鐵含量也逐漸上升。
　　3. MIRB對(duì)hDPSCs體外生物學(xué)特性的影響。采用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)、CCK8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、體內(nèi)外成骨誘導(dǎo)等手段分別檢測(cè)了 MIRB標(biāo)記對(duì)

6、hDPSCs的活力、增殖、干細(xì)胞表型、細(xì)胞周期、凋亡以及成骨分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12.5-50μg/mL的MIRB標(biāo)記不影響hDPSCs的活力且可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，而100μg/mL則對(duì)細(xì)胞有毒性，最佳標(biāo)記濃度為12.5μg/mL；12.5μg/mL的MIRB標(biāo)記不影響hDPSCs的干細(xì)胞表型；12.5μg/mL-50μg/mL的MIRB標(biāo)記可以加快細(xì)胞周期而對(duì)細(xì)胞凋亡無影響；12.5μg/mL-50μg/mL的MIRB對(duì)hDPSCs成

7、骨分化無影響。
　　4. MIRB標(biāo)記牙髓干細(xì)胞的體外、體內(nèi)MRI成像觀察。通過MRI檢測(cè)手段，體外觀察了MIRB標(biāo)記的hDPSCs細(xì)胞團(tuán)塊，體內(nèi)觀察了MIRB標(biāo)記的細(xì)胞膜片在裸鼠皮下的生長(zhǎng)情況。體外結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12.5μg/mL的MIRB標(biāo)記1×105個(gè)細(xì)胞無法在MRI清晰顯影，而用12.5μg/mL-100μg/mL的MIRB標(biāo)記1×106個(gè)細(xì)胞均可清晰顯影。體內(nèi)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIRB標(biāo)記的hDPSCs細(xì)胞膜片在MRI下可以清晰呈負(fù)

8、性對(duì)比影像，且隨著植入時(shí)間延長(zhǎng)，無信號(hào)影像所占比率也逐漸下降。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，膜片內(nèi)普魯士藍(lán)陽性染色細(xì)胞數(shù)量也隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。
　　第二部分SPIO對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)影響
　　1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMMSCs）培養(yǎng)和鑒定。成功采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMMSCs）。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞表型測(cè)定以及多向分化能力檢測(cè)確定其干細(xì)胞屬性。
　　2. Resovist標(biāo)記r

9、BMMSCs。分別用終濃度為25、50、100μg/mL的SPIO（Resovist）標(biāo)記rBMMSCs，利用普魯士藍(lán)染色光鏡觀察以及透射電鏡等手段觀察了 Resovist納米顆粒在 rBMMSCs細(xì)胞內(nèi)的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， Resovist同樣可以不需要轉(zhuǎn)染劑即可高效的標(biāo)記rBMMSCs。
　　3. Resovist對(duì)rBMMSCs生物學(xué)特性的影響。采用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)、CCK8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、體外成骨誘導(dǎo)等手段分別檢測(cè)了Re

10、sovist標(biāo)記對(duì)rBMMSCs的活力、增殖、細(xì)胞周期、凋亡以及成骨分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25-50μg/mL的Resovist對(duì)rBMMSCs活力沒有影響，而100μg/mL對(duì)細(xì)胞有毒性；25μg/mL不影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及凋亡，而50-100μg/mL則抑制細(xì)胞增殖、減緩細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明25μg/mL的Resovist是標(biāo)記rBMMSCs的合適濃度；25μg/mL的Resovist對(duì)rBMMSCs的成骨分化有促進(jìn)作

11、用。
　　第三部分 SPIO標(biāo)記的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外體內(nèi)磁場(chǎng)環(huán)境下遷移和定植的實(shí)驗(yàn)研究
　　1.體外磁場(chǎng)環(huán)境下SPIO標(biāo)記的rBMMSCs遷移實(shí)驗(yàn)。利用Transwell小室，在體外磁場(chǎng)環(huán)境下觀察SPIO標(biāo)記的rBMMSCs的穿膜能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磁場(chǎng)可以明顯促進(jìn)SPIO標(biāo)記的細(xì)胞穿膜。另外，我們?cè)谂囵B(yǎng)皿底部正中心粘貼磁鐵，將SPIO標(biāo)記的rBMMSCs接種后觀察細(xì)胞在培養(yǎng)皿內(nèi)的分布情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞圍繞磁鐵周圍呈圓環(huán)狀分

12、布。
　　2.體內(nèi)磁場(chǎng)環(huán)境下SPIO標(biāo)記的rBMMSCs向牙槽骨缺損處的磁靶向遷移或定植。構(gòu)建大鼠牙槽骨缺損模型，分別從靜脈途徑和局部注射途徑輸入SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從靜脈輸入的干細(xì)胞大部分被脾臟內(nèi)巨噬細(xì)胞所吞噬，在牙槽骨缺損處未見到遠(yuǎn)距離遷移的干細(xì)胞，而局部注射標(biāo)記后的干細(xì)胞由于有磁場(chǎng)作用可以大量聚集在牙槽骨缺損處。
　　結(jié)論：
　　1．第一部分研究結(jié)果表明，目前市售的最新的納米鐵顆粒MIRB可以無需添加

13、額外的轉(zhuǎn)染劑即可高效標(biāo)記人牙髓干細(xì)胞；12.5μg/mL-50μg/mL的MIRB標(biāo)記人牙髓干細(xì)胞是安全可靠的；MRI可以對(duì)植入體內(nèi)的hDPSCs細(xì)胞膜片進(jìn)行無創(chuàng)實(shí)時(shí)觀察，是干細(xì)胞移植治療中進(jìn)行細(xì)胞示蹤安全有效的手段，為未來利用牙髓干細(xì)胞移植進(jìn)行牙髓原位再生提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2．第二部分研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，德國(guó)Schering的納米鐵顆粒Resovist同樣可以無需轉(zhuǎn)染劑即可高效標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；25μg/mL的Resovi

14、st不影響大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和活力，50-100μg/mL的Resovist則抑制rBMMSCs增殖、減緩細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明25μg/mL的Resovist是標(biāo)記rBMMSCs的合適濃度；25μg/mL的Resovist對(duì)rBMMSCs的成骨分化有促進(jìn)作用，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入探究。
　　3．第三部分研究結(jié)果表明，體外磁場(chǎng)環(huán)境下可以完美模擬出標(biāo)記了SPIO的干細(xì)胞在磁場(chǎng)作用下發(fā)生靶向遷移；體內(nèi)環(huán)境下，構(gòu)建了牙