藥物活性成份在線富集毛細(xì)管電泳分析方法及其與生物大分子之間相互作用的研究.pdf

1、本論文將毛細(xì)管電泳分離技術(shù)與在線推掃富集技術(shù)、中空纖維液相微萃取技術(shù)相結(jié)合，建立了中草藥和生物樣品中的馬錢子生物堿、卡馬西平的高效、靈敏和選擇性好的CE分離檢測方法。并研究了中草藥中的馬錢子生物堿、防己生物堿、槲皮素以及卡馬西平與血清白蛋白的相互作用。在系統(tǒng)查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了以下研究工作： (1)采用在線推掃預(yù)富集一膠束毛細(xì)管電泳法建立了測定中草藥中馬錢子生物堿的新方法。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，最佳分離條件為：分離緩沖溶液為

2、50 mmol L<'-1> H<,3>PO<,4>(pH 2.0)，100 mmol L<'-1> SDS，20％乙腈(v/v)，分離電壓-20 kV，在0.5 psi下進(jìn)樣270 s，檢測波長為203 nm。與傳統(tǒng)MEKC方法相比較，靈敏度提高了100倍(以峰高計(jì))。以小檗堿為內(nèi)標(biāo)，士的寧與馬錢子堿的濃度在0.5～15 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.997，檢出限分別

3、為0.05 μg/mL和0.07 μg/mL。本方法應(yīng)用于測定中草藥馬錢子和中藥制劑伸筋活絡(luò)丸中馬錢子堿的含量，獲得滿意結(jié)果。 (2)首次將中空纖維液相微萃取(HF-LPME)與在線推掃富集膠束電動色譜法相結(jié)合，建立了測定尿樣中馬錢子生物堿的新方法。以小檗堿為內(nèi)標(biāo)，士的寧、馬錢子堿與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值與分析物濃度在20～200 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.996和0.997，士的寧與馬錢子堿的檢出限分別

4、為1 ng/mL和2 ng/mL(S/N=3：1)。 (3)建立了在線推掃富集毛細(xì)管電泳紫外檢測測定藥物和人血清中卡馬西平濃度的方法。以pH=3.0的50 mmol L<"-1> NaH<,2>PO<,4>，100 mmol L<'-1> SDS，20％乙腈為分離緩沖溶液，在0.5 psi下進(jìn)樣90 s，檢測波長214 nm，分離電壓為-20 kV。卡馬西平濃度在0.5-40 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)

5、系數(shù)為0.998，檢出限為0.1 μg/mL(S/N=3：1)。 (4)建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳紫外檢測測定血清中左旋多巴和甲基多巴的新方法，以pH=9.5的40 mmol L<'-1>硼砂為分離緩沖溶液，在0.5 psi壓力下進(jìn)樣7 s，分離電壓22 kV，檢測波長200 nm，檢測溫度25℃的條件下進(jìn)行測定，甲基多巴和左旋多巴濃度分別在0.001～0.064 mg/mL和0.001～0.071 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性

6、關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9998和0.9994，檢出限分別為0.6 μg/mL和0.8 μg/mL(信噪比為3：1)，己用于血清中甲基多巴和左旋多巴的測定。 (5)應(yīng)用熒光光譜和紫外光譜法研究了馬錢子堿與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合反應(yīng)，求得它們之間的結(jié)合常數(shù)K<,A>和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，分別為K<,A>=6.3×10<'3>，n=0.94(27℃)；K<,A>=7.7×10<'3>，n=0.97(37℃)。根據(jù)Forster非

7、輻射能量轉(zhuǎn)移理論求出了馬錢子堿與BSA之間的結(jié)合距離為3.99 nm(27℃)和4.21 nm(37℃)。探討了馬錢子堿的熒光猝滅機(jī)理，結(jié)果表明馬錢子堿能夠插入BSA內(nèi)部形成基態(tài)復(fù)合物導(dǎo)致其內(nèi)源熒光猝滅，猝滅機(jī)理主要是靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)確定了馬錢子堿與BSA之間的作用力類型主要為疏水性相互作用。 (6)在不同溫度下，用熒光猝滅光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外一可見吸收光譜，研究了防己諾林堿和粉防己堿與牛血清白

8、蛋白和人血清白蛋白(IISA)之間的相互作用。結(jié)果表明，防己諾林堿和粉防己堿對血清白蛋白有較強(qiáng)的熒光猝滅作用，根據(jù)不同溫度下防己諾林堿和粉防己堿對血清白蛋白的熒光猝滅作用，確定他們對血清白蛋白的熒光猝滅作用屬于靜態(tài)猝滅。并根據(jù)Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算出防己諾林堿和粉防己堿與血清白蛋白間的結(jié)合距離r、結(jié)合常數(shù)K<,A>和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。防己諾林堿與牛血清白蛋白之間的K<,A>=1.05×10<'5>，n=1.4，r=2.53 (

9、t=27℃)；K<,A>=3.31×10<'5>，n=1.3，r=2.70(t=37℃)；K<,A>=7.24×10<'5>，n=1.2，r=2.92(t=47℃)。防己諾林堿與人血清白蛋白之間的K<,A>=5.04×10<'5>，n=1.2，r=3.52(t=27℃)；K<,A>=5.38×10<'5>，n=1.3，r=3.81(t=37℃)；K<,A>=5.67×10<'5>，n=1.4，r=4.38(t=47℃)。粉防己堿與牛血清

10、白蛋白之間的K<,A>=1.52×10<'5>，n=1.2，r=2.34(t=27℃)；K<,A>=2.03×10<'5>，n=1.3，r=2.48(t=37℃)；K<,A>=2.89×10<'5>，n=1.4，r=2.71(t=47℃)。粉防己堿與人血清白蛋白之間的K<,A>=4.02×10<'5>，n=1.0，r=3.200(t=27℃)；K<,A>=4.76×10<'5>，n=1.2，r=3.14(t=37℃)：K<,A>=4.9

11、8×10<'5>，n=1.3，r=3.39(t=47℃)。并根據(jù)熱力學(xué)數(shù)據(jù)確定了它們之間的主要作用力類型，同時用同步熒光光譜和三維熒光光譜探討了防己諾林堿和粉防己堿對血清白蛋白構(gòu)象的影響。 (7)利用熒光光譜和紫外光譜法研究了槲皮素與牛血清白蛋白之間的相互作用。結(jié)果表明，靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致槲皮素對BSA熒光猝滅的兩大原因，槲皮素與BSA的結(jié)合常數(shù)K<,A>為2.8×10<'8>(26℃)和3.1×10<'8>(36℃

12、)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.76±0.01，根據(jù)Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論得到槲皮素與BSA之間的結(jié)合距離為3.25nm(26℃)和3.30 nm(36℃)，表明槲皮素的部分片段可以插入BSA分子內(nèi)部。通過計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)，可知該藥物與蛋白的相互作用是一個熵增加和吉布斯自由能降低的自發(fā)過程，并由此推斷槲皮素與BSA之間的作用力是以疏水相互作用為主。 (8)應(yīng)用熒光光譜和紫外光譜法研究了卡馬西平(CBZ)與牛血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)

13、結(jié)果表明，卡馬西平可以插入BSA分子內(nèi)部形成CBZ-BSA復(fù)合物而產(chǎn)生熒光猝滅。研究表明靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致卡馬西平對BSA熒光猝滅的兩大原因。求得CBZ與BSA之間的結(jié)合常數(shù)K<,A>分別為1.8×10<'4>(27℃)；2.8×10<'4>(37℃)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n：0.97(27℃)；1.01(37℃)。根據(jù)Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論求出了卡馬西平與BSA之間的結(jié)合距離為3.6 nm(27℃)和3.4 nm(37℃)