Ubp2特異性調(diào)控Lsb1泛素鏈狀態(tài)及其功能的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、泛素—蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system, UPS）是真核細(xì)胞特異性降解蛋白質(zhì)的主要場所，實現(xiàn)蛋白質(zhì)質(zhì)、量的精準(zhǔn)調(diào)控，影響甚至決定了細(xì)胞周期、免疫應(yīng)答和信號傳遞等幾乎所有的生命活動過程。蛋白的泛素化需要 E1，E2和E3級聯(lián)反應(yīng)，將泛素分子（Ub）轉(zhuǎn)移到底物蛋白的不同賴氨酸上造成翻譯后修飾的宏觀不均一性。底物蛋白上的泛素分子又可繼續(xù)被泛素修飾進而形成不同的泛素鏈修飾。而不同的泛素鏈發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。

2、去泛素化酶（DUBs）可將底物蛋白上的泛素鏈或泛素分子特異地水解下來，逆轉(zhuǎn)泛素化過程，以維持泛素—蛋白酶體系統(tǒng)的平衡。其失調(diào)使UPS系統(tǒng)紊亂，從而導(dǎo)致人類諸多疾病。研究發(fā)現(xiàn) DUBs與泛素鏈之間存在特異性對應(yīng)關(guān)系，但由于技術(shù)的限制，特定的 DUBs調(diào)控其特異性底物的泛素鏈并參與到生物學(xué)過程的機制尚屬未知，有待我們深入研究。
　　在之前的研究中，我們以芽殖酵母為研究對象，系統(tǒng)評價了酵母所有DUB的泛素鏈的特異性，發(fā)現(xiàn)USP家族的Ub

3、p2對K63鏈有偏好性。本課題以Ubp2的潛在底物L(fēng)sb1為研究對象，通過在其C端加上6×his和biotin雙標(biāo)簽的策略來系統(tǒng)描述Lsb1。經(jīng)過串聯(lián)純化和SDS-PAGE驗證，我們得到了高純度泛素化的Lsb1，證明我們的研究策略有效。純化的樣品經(jīng)過LC-MS/MS高覆蓋蛋白質(zhì)組分析，我們證實Lsb1的K41和K79位點被泛素化，驗證了以往的研究結(jié)果；與此同時我們還發(fā)現(xiàn)了K37、K85、K98和K108這4個新的泛素化位點。分別將主要的

4、修飾殘基的賴氨酸突變成精氨酸，并做SILAC-IP-MS精準(zhǔn)定量蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)Lsb1蛋白上的K41和K79位點都含有K48和K63泛素鏈的修飾，其中K41位點主要為K63鏈修飾，而K79位點主要發(fā)生K48修飾，它們受到Ubp2, Ubp3和Ubp14調(diào)控。
　　為闡明 Lsb1受 Ubp2調(diào)控的分子機制，我們開展了 Lsb1特定泛素鏈的SILAC-Protein-Protein Interacting研究。經(jīng)過SILAC定量

5、和嚴(yán)格的篩選，我們鑒定了151個高可信的Lsb1相互作用蛋白，這些蛋白主要參與氨基酸代謝、蛋白折疊、細(xì)胞離子平衡、內(nèi)吞作用等重要的生物學(xué)過程。在泛素鏈特異性結(jié)合的底物研究中，我們用相同的篩選條件得到了共45個與泛素鏈結(jié)合的蛋白，這群蛋白主要與支鏈氨基酸合成、蛋白折疊、鋅離子跨膜轉(zhuǎn)運等生物學(xué)過程。在隨后的表型實驗中也證明泛素化的 Lsb1參與酵母支鏈氨基酸的合成，這與之前的功能分析吻合，也為我們深入研究Lsb1及其泛素鏈的生物學(xué)功能提供了