亞東鮭人工繁育和翹嘴紅鲌育種群體遺傳差異分析及兩種魚的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、亞東鮭（Salmo trutta fario），國(guó)外引進(jìn)種，為棕鱒（Salmo trutta）的同物異名，在我國(guó)僅分布于西藏亞東縣亞東河及其相關(guān)支流中，現(xiàn)已形成穩(wěn)定的地方種群，完全適應(yīng)了西藏高原水域環(huán)境條件，是西藏自治區(qū)二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)水生動(dòng)物，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。
　　翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis），又稱鲌魚、大白魚等，也可稱翹嘴鲌（Culter alburnus），廣泛分布于中國(guó)各大水系，地理群體較多，

2、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值顯著，是一種優(yōu)良的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，具有很好的種質(zhì)資源保護(hù)與利用及遺傳育種潛力。
　　本論文以亞東鮭和翹嘴紅鲌兩個(gè)物種為研究對(duì)象，探究亞東鮭規(guī)?；斯し庇P(guān)鍵技術(shù)，并從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度初步探討其對(duì)高原水域環(huán)境的適應(yīng)性分子機(jī)制；運(yùn)用微衛(wèi)星（SSR）分子標(biāo)記分析翹嘴紅鲌育種群體的遺傳差異，也從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度探討翹嘴紅鲌免疫相關(guān)基因表達(dá)與調(diào)控的分子機(jī)制。具體內(nèi)容如下：
　　1、亞東鮭規(guī)?；斯し庇芯?br>　　為完善和熟

3、化亞東鮭在西藏亞東地區(qū)的規(guī)?；斯し庇夹g(shù)，本文從親魚挑選及培育、人工采卵授精、孵化管理、開口馴食等方面開展了西藏亞東鮭規(guī)模化人工繁育試驗(yàn)。其結(jié)果如下：（1）挑選無傷病、體質(zhì)健壯的親魚，雌魚3齡及以上，體重1.0kg以上，雄魚2齡及以上，體重2.0kg以上；強(qiáng)化培育過程中，投喂優(yōu)質(zhì)飼料，增加親魚的營(yíng)養(yǎng)；適當(dāng)增大入水口水流量，以促進(jìn)親魚的性腺發(fā)育；（2）調(diào)試好人工授精用的平衡鹽溶液，提高受精率，此次試驗(yàn)的平均受精率為96％；正確進(jìn)行人工采

4、卵采精操作，共59.3萬粒卵，出苗數(shù)總計(jì)39.7萬尾，培育成的苗種數(shù)共31.2萬尾；（3）最佳孵化水溫為8~10℃；加溫的一批的孵化率為81%，明顯高于未加溫的一批（46%）；孵化期間，定時(shí)更換孵化水，及時(shí)剔除死卵，以防止產(chǎn)生水霉，影響正常卵的發(fā)育；（4）魚苗出膜后適宜放養(yǎng)密度約為1萬尾/m3水體；在水溫10~15℃，經(jīng)過20天左右，可以進(jìn)行開口馴食；選擇雞蛋黃過濾液為開口餌料，之后投喂優(yōu)質(zhì)的冷水鮭鱒魚類專用飼料；投喂時(shí)，停水停氣適當(dāng)時(shí)

5、間，根據(jù)魚苗吃食情況調(diào)整投喂次數(shù)和時(shí)間，使魚苗充分?jǐn)z食；定時(shí)清污，保證水中溶氧充足；馴食結(jié)束后，魚苗體長(zhǎng)增長(zhǎng)了67.16%。
　　2、基于高通量測(cè)序的亞東鮭轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
　　為研究亞東鮭功能基因組信息，基于Illumina HiseqTM4000高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)亞東鮭全組織（腦、心臟、鰓、肝臟、腸、肌肉、精巢或卵巢、腎臟、脾臟和眼睛）混合樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了亞東鮭轉(zhuǎn)錄組信息。結(jié)果顯示，共獲得46,960,387條raw

6、 reads，總核苷酸長(zhǎng)度為14.1×109bp；過濾后，共得到35,998,548條clean reads；利用Trinity軟件進(jìn)行拼接和組裝共獲得153,365個(gè)轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度為971bp。利用NCBI非冗余序列數(shù)據(jù)庫（NCBI-NR）對(duì)全部轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行相似性搜索（BLAST），共81,505個(gè)轉(zhuǎn)錄本（53.14%）與已知序列同源。利用Blast2GO軟件進(jìn)行功能注釋，共獲得 GO功能和KEGG代謝通路注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目分別為38,

7、518（25.12%）、32,438（21.15%）。根據(jù)GO基因功能分類，本次注釋分為3個(gè)大類39個(gè)亞類，其中生物學(xué)過程（biological process）19個(gè)、分子功能（molecular function）10個(gè)、細(xì)胞組分（cellular component）10個(gè)。通過KEGG的自動(dòng)注釋服務(wù)（KAAS）分析，13,394個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋到280條代謝通路中。經(jīng)過進(jìn)一步分析，有6條通路可能與高原環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)，涉及365個(gè)

8、功能基因，同時(shí)探討了這些通路中相關(guān)功能基因表達(dá)與調(diào)控的分子機(jī)制。
　　3、翹嘴紅鲌育種群體的遺傳差異與親緣關(guān)系分析
　　利用微衛(wèi)星（SSR）標(biāo)記對(duì)翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis）4個(gè)育種群體（黑龍江水系群體、淮河水系群體、長(zhǎng)江上游水系群體和長(zhǎng)江下游水系群體）的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：4個(gè)育種群體均存在雜合子缺失現(xiàn)象，群體內(nèi)近親繁育程度較高，群體遺傳多樣性水平較低；群體間遺傳差異的分子方

9、差分析（AMOVA）顯示，遺傳變異主要來源于群體內(nèi)個(gè)體間，群體間的變異為17.58%（FST＝0.1758，P＜0.001）；NJ聚類樹顯示，黑龍江水系群體與淮河水系群體的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，長(zhǎng)江上游水系群體與長(zhǎng)江下游水系群體的遺傳關(guān)系最近；而STRUCTURE遺傳聚類分析顯示，4個(gè)育種群體各自單獨(dú)聚為一類為其最佳遺傳分組。結(jié)果綜合表明，4個(gè)育種群體的遺傳變異較小，遺傳多樣性水平均較低；在育種時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大親本來源，增加親本數(shù)量，充實(shí)育種群

10、體的遺傳多樣性。
　　4、翹嘴紅鲌免疫相關(guān)基因與通路的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)翹嘴紅鲌各組織RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。通過Trinity拼接軟件，共獲得102,017個(gè)轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度為945 bp，其中可預(yù)測(cè)到蛋白表達(dá)序列45,482條。基于NCBI非冗余序列數(shù)據(jù)庫（NCBI-NR）和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt），通過序列相似性比對(duì)（BLAST）搜索，分別獲得了53,575和45,602個(gè)具有同源序列的轉(zhuǎn)

11、錄本。進(jìn)一步的GO功能注釋到24,052個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分為生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞組分3個(gè)大類和38個(gè)亞類。19,260個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋到KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫中的276條代謝通路中，其中包含Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、B細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（B cell receptor signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（T cell receptor