具有不同疏水性的聚陰離子誘導脫輔基細胞色素c和細胞色素c的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換.pdf

1、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換(折疊與去折疊)是蛋白質(zhì)研究的重要領域。蛋白質(zhì)的正確折疊是體現(xiàn)其生物功能的基礎，也是生物學中最基本和最普遍的自組裝模式。蛋白質(zhì)肽鏈在體內(nèi)如何折疊主要取決于其一級結(jié)構(gòu)和肽鏈所位于的細胞環(huán)境，一般來說，蛋白質(zhì)能自發(fā)地折疊成具有特定空間結(jié)構(gòu)和生物功能的分子。但是環(huán)境因素的改變會使肽鏈發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，也就是說蛋白質(zhì)采取何種空間結(jié)構(gòu)不但受肽鏈自身熱力學穩(wěn)定性的控制，還受到蛋白質(zhì)分子所處的微環(huán)境和動力學過程的影響。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換在生

2、物體內(nèi)是一個普遍現(xiàn)象，近年來的醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在人體內(nèi)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和錯誤折疊會引起嚴重的疾??；另一方面，重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的高效表達常常導致無活性的變性蛋白質(zhì)聚集體，即包涵體的生成。因此，研究蛋白質(zhì)的折疊機理和發(fā)展促使蛋白質(zhì)復性的方法無論在理論上還是在應用上都有很重要的意義。 在細胞內(nèi)，有一類稱為分子伴侶(molecularchaperone)的蛋白質(zhì)分子協(xié)助新生肽鏈進行正確的非共價鍵組裝。分子伴侶對其靶蛋白并沒有特異性識

3、別，本身不參與最終產(chǎn)物的形成，也不包括控制正確折疊所需要的構(gòu)象信息，而只是阻止非天然的多肽鏈內(nèi)部或多肽鏈之間不正確的相互作用。分子伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)折疊的方法為蛋白質(zhì)復性提供了一個可能性。90年代初，Cleland及合作者報道了兩親性的合成高分子聚乙二醇(PEG)可以作為蛋白質(zhì)折疊促進劑。近年來，又有一些關于高分子作為折疊促進劑的報道。隨著高分子科學的迅速發(fā)展，已經(jīng)可以按照高分子功能性的要求設計和合成出具有指定單體單元結(jié)構(gòu)、鏈結(jié)構(gòu)、分子量的

4、多種均聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物等。尤其重要的是，可以通過分子設計將具有環(huán)境響應性質(zhì)的疏水和親水的結(jié)構(gòu)單元以不同的組合方式連接于合成高分子中，它們不但在單分子狀態(tài)具有可調(diào)節(jié)和環(huán)境響應的結(jié)構(gòu)變換及疏水—親水平衡，還能形成可控尺寸的自組裝。因此，可以利用不同的合成高分子研究各種作用力對蛋白質(zhì)折疊的影響，并尋找合成高分子促進蛋白質(zhì)折疊的結(jié)構(gòu)模式。在本論文中，用磺化聚苯乙烯、馬來酸—烯烴交替共聚物研究了靜電、疏水作用和氫鍵對細胞色

5、素c和脫輔基細胞色素c結(jié)構(gòu)的影響。細胞色素c是一個堿性蛋白質(zhì)，等電點為pH10．6；脫輔基細胞色素c是細胞色素c的前體蛋白質(zhì)，不含輔基血紅素，在溶液中以無規(guī)卷曲構(gòu)象形式存在。 論文工作的第一部分研究了磺化聚苯乙烯和脫輔基細胞色素c的相互作用。龔潔在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)磺化聚苯乙烯可以誘導脫輔基細胞色素c從無規(guī)卷曲構(gòu)象折疊為α-螺旋結(jié)構(gòu)。脫輔基細胞色素c的α-螺旋含量與磺化聚苯乙烯的分子量、磺化度、濃度以及溶液的pH、離子強度有關。

6、在此基礎上，我用動態(tài)光散射、熒光光譜和原子力顯微鏡方法對磺化聚苯乙烯和脫輔基細胞色素c的相互作用進行了進一步地表征。我們發(fā)現(xiàn)，滴加磺化聚苯乙烯溶液(THF／H20，50／50，v／v)到水溶液中可以形成納米粒子，粒子表面的磺酸負電荷使其穩(wěn)定地分散在水溶液中；粒徑的火小與聚合物濃度和低濃度的鹽無關，但隨溶液pH的增加而增加。在酸性和中性溶液中磺化聚苯乙烯和脫輔基細胞色素c發(fā)生相互作用形成復合物粒子，其尺寸與兩者的濃度比有關。當磺化聚苯乙烯

7、過量時，富集在復合物粒子表面的負電荷阻止了粒子的進一步聚集；而當脫輔基細胞色素c過量時，脫輔基細胞色素c可能促使復合物粒子進一步聚集。以芘為探針的熒光光譜表明，脫輔基細胞色素c不僅中和了磺化聚苯乙烯粒子表面的負電荷，而且可能插入其疏水內(nèi)核，破壞了磺化聚苯乙烯粒子的原始結(jié)構(gòu)，這類似于脫輔基細胞色素c與磷脂的反應。因此，磺化聚苯乙烯粒子可以部分地模擬磷脂膜的微環(huán)境。 論文工作的第二部分研究了馬來酸—烯烴交替共聚物對脫輔基細胞色素c結(jié)

8、構(gòu)轉(zhuǎn)換的影響。馬來酸—烯烴交替共聚物的疏水—親水性可以通過選擇不同長度的疏水側(cè)鏈和溶液的pH來進行調(diào)節(jié)，因此是研究靜電、疏水和氫鍵作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換影響的一個很好模型。在這里，我選擇了馬來酸一十四烯交替共聚物(PTMA)和馬來酸—異丁烯交替共聚物(PIMA)來研究對脫輔基細胞色素c折疊的誘導作用。在pH為2．1，6．5，10．5和11．8溶液中，PIMA的電離度分別為11％，53％，87％和100％；PTMA電離度分別為8％，55％，

9、97％和100％。在水溶液中，親水的PIMA鏈主要采取伸展的構(gòu)象；而疏水的PTMA聚集形成膠束，位于膠束表面的羧酸根負離子使膠束穩(wěn)定。當溶液中PTMA濃度降低和pH增大時，膠束會發(fā)生解離。圓二色性光譜、熒光光譜和原子力顯微鏡研究表明，當溶液pH從酸性變到堿性時，脫輔基細胞色素c從伸展的無規(guī)卷曲構(gòu)象，即UA態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂臒o規(guī)卷曲構(gòu)象，即C態(tài)。加入馬來酸—烯烴交替共聚物后，脫輔基細胞色素c從無規(guī)卷曲構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋結(jié)構(gòu)。α-螺旋含量與共聚

10、物的濃度、疏水鏈的長度以及溶液的pH有關。在pH2．1時，每個脫輔基細胞色素c分子帶有24個正電荷，因此共聚物和蛋白質(zhì)之間的靜電吸引作用可以削弱肽鏈內(nèi)的靜電斥力，有利于蛋白質(zhì)折疊。在pH11．8時，共聚物和蛋白質(zhì)都帶負電荷，PIMA的烷基側(cè)鏈太短，不能誘導脫輔基細胞色素c折疊；而帶有十四烷基側(cè)鏈的PTMA仍然可以誘導脫輔基細胞色素c形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，說明疏水作用也是誘導蛋白質(zhì)折疊的一個重要因素。蛋白質(zhì)和共聚物之間的靜電和疏水作用排擠了與

11、蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子，減少了蛋白質(zhì)與水分子之間的氫鍵，促進了肽鏈內(nèi)部氫鍵，從而有利于α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成。另外，共聚物中離子化的羧酸基團可以和蛋白質(zhì)肽鏈上的酰胺基團形成強氫鍵，抑制肽鏈內(nèi)氫鍵和α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成。動態(tài)光散射研究表明，在溶液pH小于蛋白質(zhì)等電點時，當正負電荷比接近化學計量時，共聚物和脫輔基細胞色素c相互作用會生成沉淀；否則，過量的脫輔基細胞色素c正電荷或過量的共聚物負電荷可以防止復合物的進一步聚集而形成穩(wěn)定的粒子。在中性和堿性

12、溶液中，共聚物和蛋白質(zhì)之間的相互作用破壞了PTMA和脫輔基細胞色素c自身的疏水聚集，形成了新的聚集體。在體系中，共聚物與脫輔基細胞色素c之間的相互作用和共聚物與蛋白質(zhì)自身的疏水聚集之間存在競爭。相對于小分子折疊促進劑，用高分子誘導蛋白質(zhì)折疊有兩個優(yōu)點：(1)濃度低；(2)相互作用可調(diào)。 論文工作的第三部分研究了在與馬來酸—烯烴交替共聚物結(jié)合和解離過程中細胞色素c結(jié)構(gòu)的可逆轉(zhuǎn)換。球蛋白與帶相反電荷的聚合物相互作用后，根據(jù)溶液中聚合

13、物與蛋白質(zhì)濃度以及溶液pH和離子強度的不同，可以生成可溶性的復合物、凝聚物或沉淀。因此，聚合物可以用來分離和純化蛋白質(zhì)、固定和穩(wěn)定酶、促進蛋白質(zhì)折疊、包埋與控制釋放蛋白質(zhì)。聚合物和蛋白質(zhì)之間可以發(fā)生靜電、疏水和氫鍵相互作用，而這些相互作用也是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要因素和誘導蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的主要驅(qū)動力。據(jù)我們所知，目前還沒有關于聚合物和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合和釋放對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響的系統(tǒng)研究。因此，我用圓二色性光譜、吸收光譜和原子力顯微鏡研究了PI

14、MA與PTMA分別和細胞色素c結(jié)合和解離過程中靜電和疏水作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。在生理pH7．4時，PIMA僅部分地破壞了細胞色素c中血紅素疏水袋結(jié)構(gòu)的完整性而對色氨酸的不對稱環(huán)境沒有影響，而PTMA完全破壞了細胞色素c中血紅素疏水袋結(jié)構(gòu)的完整性和色氨酸的不對稱環(huán)境，即PTMA與細胞色素c之間的疏水作用完全破壞了細胞色素c的疏水核結(jié)構(gòu)。二者均對細胞色素c的二級結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。在馬來酸—烯烴交替共聚物和蛋白質(zhì)復合物中，加入相當于生理離子

15、強度的0．15MNaCl可以破壞PIMA和細胞色素c的復合物粒子，被釋放出的細胞色素c恢復其天然結(jié)構(gòu)；相反，由于PTMA和細胞色素c之間更強的疏水作用，0．15MNaCl對其沒有明顯的影響。加入0．5M鹽酸胍到PTMA和細胞色素c復合物中，鹽酸胍可以與PTMA發(fā)生靜電和疏水作用生成PTMA-鹽酸胍沉淀而將細胞色素c釋放出來，被釋放的細胞色素c恢復了天然結(jié)構(gòu)。這表明，聚合物可以通過疏水作用與蛋白質(zhì)形成更穩(wěn)定復合物，同時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也被更嚴