miR-1246的靶基因驗證及其在高溫誘導(dǎo)下對牛肺細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、miR-1246定位于人2號染色體長臂31區(qū)1亞帶（2q31.1）。研究表明，miR-1246的表達(dá)受 p53調(diào)控，并參與調(diào)節(jié)生長發(fā)育、新陳代謝、自身免疫、細(xì)胞増殖調(diào)亡、逆境脅迫等生物學(xué)過程。
　　本課題組前期研究證明，miR-1246在熱應(yīng)激期與非熱應(yīng)激期的牛血液中含量具有顯著差異（P＜0.05）。但miR-1246是否參與機體熱應(yīng)激調(diào)控尚不清楚。為進(jìn)一步揭示miR-1246對熱應(yīng)激牛機體的調(diào)控作用，本研究首先利用生物信息學(xué)方法

2、對miR-1246靶基因進(jìn)行了初步分析。結(jié)果顯示，cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白類似因子（CREBL2）、多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白（PCBP2）、鋅指蛋白類似因子（ZFP36L1）等基因mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）含有miR-1246的結(jié)合位點；進(jìn)一步對這些miR-1246的潛在靶基因功能和參與的信號通路分析發(fā)現(xiàn)其主要富集在腫瘤發(fā)生相關(guān)通路中。為驗證 miR-1246對這些潛在靶基因的調(diào)控作用，我們分別擴增了CREBL2、PCBP2和ZFP

3、36L1基因3’UTR序列，并合成了 miR-1246過表達(dá)（miR-1246 mimic）和對照（NC）質(zhì)粒，并通過轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)miR-1246過表達(dá)能極顯著下調(diào)CREBL2和PCBP2基因表達(dá)水平（P＜0.01）。進(jìn)一步通過 Real-time PCR和 Western Blot技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)， miR-1246對CREBL2和PCBP2基因mRNA和蛋白表達(dá)均有顯著抑制作用（P＜0.05）。

4、r>　　根據(jù)已有的研究，CREBL2和PCBP2的功能主要與細(xì)胞凋亡和生長抑制相關(guān)。本研究最后利用 DAPI細(xì)胞核染色技術(shù)、Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞雙染技術(shù)對熱應(yīng)激條件下牛肺細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，miR-1246能減輕熱應(yīng)激后牛肺細(xì)胞的凋亡和緩解熱應(yīng)激牛肺細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。以上結(jié)果表明，miR-1246可能通過抑制細(xì)胞凋亡來調(diào)控機體熱應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)。
　　總之，本研究從體外水平上揭示了miR-1246是機體熱應(yīng)激生