耐乙醇巴氏醋桿菌的構(gòu)建及其胞內(nèi)代謝物研究.pdf

1、食醋發(fā)酵中，醋酸菌不可避免地受到乙醇、乙酸以及高溫等環(huán)境因素的脅迫，會嚴(yán)重影響其發(fā)酵速率，發(fā)酵效率及其產(chǎn)量，同時也會增加生產(chǎn)成本。乙醇作為醋酸菌的發(fā)酵底物，不僅影響發(fā)酵效率、食醋產(chǎn)量，對醋酸菌自身的生長也會造成影響。本文嘗試?yán)梅肿由飳W(xué)的方法，對常用的食醋釀造菌巴氏醋桿菌（Acetobacterpasteurianus）進(jìn)行改造，成功構(gòu)建出一株具有一定乙醇耐受性能的工程菌株。并對其進(jìn)行了發(fā)酵性能檢測和代謝組學(xué)研究，為進(jìn)一步探討乙醇耐受

2、機(jī)制及改造菌種提供了依據(jù)。
　　據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道編碼磷酸組氨醇氨基轉(zhuǎn)移酶的hisl基因與乙醇的耐受性相關(guān)。根據(jù)已公布的hisl基因序列的信息設(shè)計引物，以滬釀1.01菌株(AP)的基因組DNA為模板擴(kuò)增出目的片段，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，并導(dǎo)入到巴氏醋桿菌中成功構(gòu)建了能夠耐受高濃度乙醇的工程菌株T1。在9％(v/v)乙醇濃度的發(fā)酵條件下，其醋酸產(chǎn)量達(dá)到37.66±1.51g/L，比原始菌株AP的產(chǎn)量（12.93±2.89 g/L）提高了191

3、.07％。
　　利用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)的代謝組學(xué)，分析了工程菌株與原始菌株在高濃度乙醇發(fā)酵條件下的胞內(nèi)代謝物變化，并對其乙醇耐受機(jī)制進(jìn)行了初步探討。代謝組學(xué)分析結(jié)果表明，乙醇脅迫下T1細(xì)胞中碳代謝、脂代謝和氨基酸代謝相關(guān)物質(zhì)含量發(fā)生了改變。在乙醇脅迫條件下，菌株的糖酵解途徑與三羧酸循環(huán)受到不同程度地抑制，但工程菌株T1在乙醇脅迫下仍能維持較高的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶酶活，使其乙醇氧化產(chǎn)能途徑能很好地運(yùn)行，為菌體提

4、供足夠的能量，維持細(xì)胞生長，來抵抗外界不利因素。同時菌體內(nèi)合成了大量的脯氨酸、谷氨酸和海藻糖等細(xì)胞保護(hù)性物質(zhì)，對菌體自身起到保護(hù)作用。乙醇脅迫下菌體中飽和脂肪酸的合成會受到抑制，不飽和脂肪酸含量增加，使得飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比值減小，表明乙醇濃度會改變細(xì)胞膜流動性。在乙醇脅迫下菌株T1能夠有效地調(diào)節(jié)自身脂肪酸的合成，減小膜的流動性。乙醇脅迫下T1細(xì)胞膜脂肪酸的調(diào)節(jié)主要是通過調(diào)節(jié)十六烷酸、十八烷酸和油酸的合成量。
　　綜上所述，