FOXO3a在柴油機(jī)尾氣有機(jī)提取物誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化損傷中的作用研究.pdf

1、目的：柴油機(jī)尾氣是指柴油發(fā)動機(jī)燃燒柴油后噴出的尾氣，隨著柴油機(jī)的廣泛應(yīng)用，柴油機(jī)尾氣暴露與人體健康的關(guān)系越來越受到關(guān)注。近年來研究表明，柴油機(jī)尾氣通過引起氧化損傷、DNA損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞毒性作用等，嚴(yán)重?fù)p害人體健康。叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型(forkhead box type-o3, FOXO3a)是一個重要的抗氧化應(yīng)激因子，在氧化損傷過程中起著十分重要的作用，但 FOXO3a在柴油機(jī)尾氣所致的氧化損傷中發(fā)揮的作用仍不清楚。因此探討FO

2、XO3a在柴油機(jī)尾氣有機(jī)提取物(organic extracts of diesel exhaust, OEDE)導(dǎo)致?lián)p傷效應(yīng)中的作用就具有十分重要的意義。本研究通過檢測OEDE對16HBE細(xì)胞造成的氧化損傷，以FOXO3a為切入點(diǎn)，探討FOXO3a在OEDE導(dǎo)致的細(xì)胞毒效應(yīng)中的作用。
　　方法：
　　1柴油機(jī)尾氣有機(jī)提取物的采集及制備
　　利用氣體采樣器，通過聚四氟乙烯(PTFE)濾膜收集柴油機(jī)尾氣顆粒物(diese

3、l exhaust particle, DEP)。二氯甲烷超聲，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解完全干燥的提取物。
　　2細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞模型建立
　　人支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)于含10％胎牛血清的 MEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。選對數(shù)生長期的細(xì)胞，用OEDE處理24小時，劑量分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL；以MEM為陰性對照。

4、　　FOXO3a的表達(dá)質(zhì)粒FOXO3a TM以及靶向沉默F(xiàn)OXO3a的siRNA用于瞬時轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR檢測FOXO3a表達(dá)水平。用劑量為10μg/mL的OEDE處理轉(zhuǎn)染siRNA FOXO3a、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒FOXO3a TM的細(xì)胞，分別以轉(zhuǎn)染siRNA control、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1為陰性對照。
　　3細(xì)胞形態(tài)的觀察
　　通過倒置顯微鏡觀察OEDE染毒后16HBE細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　4細(xì)胞氧

5、化損傷指標(biāo)的測定
　　將染毒處理后的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，孵育2,7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(2,7-dichlorodihydrf-luorescein diacetate,DCFH-DA)熒光探針，流式細(xì)胞儀檢測不同劑量 OEDE處理16HBE細(xì)胞后活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量。
　　應(yīng)用生化試劑盒檢測16HBE細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase

6、, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性，以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量。
　　5細(xì)胞DNA損傷的測定
　　應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(single cell gel electrophoresis, SCGE)，通過Olive尾矩的變化，檢測16HBE細(xì)胞DNA損傷的程度。
　　6細(xì)胞修復(fù)能力的測定
　　瞬時轉(zhuǎn)染氯化鎘

7、(2μmol/L)受損質(zhì)粒pGL3-Control和pRL-TK質(zhì)粒，以不同濃度的OEDE作用16HBE細(xì)胞24小時后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測樣品中雙熒光素酶的表達(dá)情況，以蟲熒光素酶和海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度的比值來反應(yīng)DNA修復(fù)能力。
　　7細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的測定
　　OEDE處理16HBE細(xì)胞后收獲，RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白，采用 Western blot方法檢測 FOXO3a和磷酸化叉形頭轉(zhuǎn)錄因子 O亞

8、型(phosphorylate forkhead box type-o3, pFOXO3a)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1 OEDE對16HBE細(xì)胞形態(tài)的影響
　　倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)的16HBE細(xì)胞形態(tài)完整，呈長形,胞質(zhì)較多，排列較為疏松，貼壁緊密生長，折光率高。染毒處理后，細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)減少，排列非常緊密，貼壁能力下降，折光率減弱，有些細(xì)胞脫落漂浮于培養(yǎng)液中。說明OEDE對細(xì)胞形態(tài)有一定程度的影響。

9、
　　2 FOXO3a低、高表達(dá)細(xì)胞株的鑒定
　　與轉(zhuǎn)染 siRNA control的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染 siRNA FOXO3a的細(xì)胞FOXO3a基因mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 FOXO3a TM的細(xì)胞FOXO3a基因mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明FOXO3a低、高表的細(xì)胞株的構(gòu)建是成功的。
　　3 O

10、EDE對16HBE細(xì)胞氧化損傷的影響
　　不同劑量OEDE處理16HBE細(xì)胞24h后，隨著濃度的增加，ROS水平逐漸升高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SOD和GSH-Px活力逐漸降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MDA含量逐漸升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明OEDE可以誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化損傷，使細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激。
　　4 OEDE對16HBE細(xì)胞DNA

11、的損傷
　　不同劑量OEDE處理16HBE細(xì)胞24h后，隨著染毒濃度的增加，各劑量組Olive尾矩顯著增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；說明OEDE可以誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷。
　　5細(xì)胞修復(fù)能力的改變
　　隨著 OEDE濃度的增加，蟲熒光素酶和海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度的比值逐漸降低，即16HBE細(xì)胞DNA的修復(fù)能力逐漸下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明OEDE抑制細(xì)胞DNA的修復(fù)

12、能力。
　　6 OEDE對16HBE細(xì)胞中FOXO3a和pFOXO3a蛋白表達(dá)水平的影響
　　隨著 OEDE濃度的增加， FOXO3a和 pFOXO3a蛋白表達(dá)水平在5μg/ml、10μg/ml劑量組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而20μg/ml劑量組表達(dá)量明顯低于各劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。pFOXO3a和 FOXO3a的比值隨濃度增加逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明O

13、EDE影響FOXO3a與pFOXO3a蛋白表達(dá)水平，pFOXO3a發(fā)揮主要作用。
　　7調(diào)控FOXO3a表達(dá)對細(xì)胞氧化損傷的影響
　　經(jīng)OEDE染毒后，F(xiàn)OXO3a低表達(dá)細(xì)胞MDA、ROS水平升高，SOD、GSH-Px活力降低，OTM值增加，與FOXO3a正常表達(dá)細(xì)胞相比各值均有明顯差異(P<0.05)。而FOXO3a高表達(dá)細(xì)胞MDA、ROS水平下降，SOD、GSH-Px活力提高，OTM值減小，與FOXO3a正常表達(dá)細(xì)胞相比