RXR motif在倍半粘合酶催化產(chǎn)物特異性中的作用.pdf

1、萜類化合物普遍存在于植物、微生物的次級代謝產(chǎn)物中。隨著越來越多的萜類化合物的發(fā)現(xiàn)，對萜類合酶的研究也更加深入，這不僅可以幫助我們從理論上認識萜類化合物的合成機制，理解萜類合酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，還可以幫助在藥物、香精等應(yīng)用方面的研究更進一步。萜類合酶不同的催化機理是揭示萜類化合物數(shù)量和結(jié)構(gòu)多樣性的關(guān)鍵，對其保守基序DDXXD、NSE/DTE、RXR的研究更是其中的重點。本文選取了倍半萜合酶保守基序 RXR作為研究切入口，探討在兩種不同的倍

2、半萜合酶催化機制中該保守基序?qū)Υ呋a(chǎn)物特異性的影響，并做了如下工作：
　　1.為探討RXR基序?qū)Ρ栋胼骗h(huán)化酶產(chǎn)物特異性的影響，選擇對青蒿紫穗槐二烯合酶（ADS）R262、R264進行單突變，并將R262K和T296A/V/I進行聯(lián)合突變，發(fā)現(xiàn)：R262輔助farnesyl diphosphate（FPP）離子化釋放焦磷酸基團需要側(cè)鏈氨基的存在，但是環(huán)化反應(yīng)中間產(chǎn)物 nerolidyl diphosphate（(R,E)-NPP）的

3、離子化不需要R262的協(xié)助就可以實現(xiàn)。推測T296A/V/I可以和 R262K通過其他氨基孫或底物碳骨架發(fā)生相互作用，而且這種相互作用的結(jié)果跟底物構(gòu)象有關(guān)，雙突變不能作用于(E,E)-FPP，但是可以催化(R,E)-NPP、(S,E)-NPP分別生成對應(yīng)的amorpha-4,7(11)-diene和farnesene，以及二者共有的nerolidol、α-bisabolol，作用于(Z,E)-FPP時，雙突變可以抑制 R262K環(huán)化反應(yīng)

4、中陽離子中間體對水的捕獲。R264K對產(chǎn)物沒有影響。
　　2.為探討RXR基序?qū)Ψ词奖栋胼骗h(huán)化酶產(chǎn)物特異性的影響，選擇反式環(huán)化酶煙草馬兜鈴烯合酶（TEAS）R264、R266進行單突變，發(fā)現(xiàn)：雖然TEAS催化(Z,E)-FPP經(jīng)歷順式異構(gòu)，但是R264K并不能明顯增加產(chǎn)物中萜醇的生成；底物伯碳位焦磷酸基團的釋放需要266位側(cè)鏈含氨基的殘基協(xié)助，但是叔碳位焦磷酸的基團則不需要該位點發(fā)揮作用。R266K突變體使酶喪失活性。