指狀青霉DSM 62840轉(zhuǎn)化檸檬烯為α-松油醇的微生物轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、檸檬烯是一種重要的功能性單萜，在食品中作為香精香料添加劑被廣泛使用，其含氧衍生物具更高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。與傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和，區(qū)域和立體選擇性好，環(huán)境友好且獲得的為“天然”產(chǎn)品。通過微生物轉(zhuǎn)化，可以將檸檬烯轉(zhuǎn)化為香氣更濃，應(yīng)用更為廣泛的、商業(yè)價(jià)值更高的香芹醇、香芹酮、紫蘇酸、α-松油醇等物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)先利用SPME-GC-MS，分析檢測了三株真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum CICC41029)、指狀青霉（

2、Penicillium digitatum DSM62840）并口青霉（Penicillium sp.）對檸檬烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，以α-松油醇為目標(biāo)產(chǎn)物，根據(jù)各個(gè)菌株微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類和含量，選出最優(yōu)轉(zhuǎn)化菌株;然后對指狀青霉（Penicilliumdigitatum DSM62840）轉(zhuǎn)化檸檬烯為α-松油醇的過程進(jìn)行條件優(yōu)化并對轉(zhuǎn)化過程中的酶進(jìn)行了初步研究;最后采用iTRAQ技術(shù)對指狀青霉(Penicillium digitatumDSM6

3、2840)對檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化不同時(shí)期(12h和0h)的蛋白表達(dá)做了比較，鑒定得到的差異蛋白為深入研究指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）對檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、疟容^三株真菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum CICC41029）、指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）和青霉（Penicillium sp.）

4、生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的產(chǎn)物，利用SPME-GC-MS固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜連用的方法對發(fā)酵液進(jìn)行檢測，總共得到13種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中薄荷烯酮、異薄荷烯酮、異佛爾酮為尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum CICC41029）所獨(dú)有的產(chǎn)物，紫蘇醇、紫蘇醛為青霉（Penicillium sp.）所獨(dú)有的產(chǎn)物，γ-松油烯、α-異松油烯、α-松油醇為指狀青霉（Penicillium digitatumDSM62840）所獨(dú)有的產(chǎn)物;1-對薄

5、荷烯-9-醛為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumCICC41029）和青霉（Penicillium sp.）所共有的產(chǎn)物，脫氫香芹酮、香芹醇為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum CICC41029）和指狀青霉（Penicillium digitatumDSM62840）所共有的產(chǎn)物，1，3，8-p-Menthatriene為青霉（Penicillium sp.）和指狀青霉（Penicillium digita

6、tum DSM62840）所共有的產(chǎn)物;3株真菌均能在檸檬烯2位進(jìn)行氧化得到香芹酮。指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）可以在24h時(shí)生成202±14.7mg/L的α-松油醇，表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)化檸檬烯的能力。
　?、茖χ笭钋嗝梗≒enicillium digitatum DSM62840）轉(zhuǎn)化檸檬烯為α-松油醇的過程進(jìn)行條件優(yōu)化，分別研究不同指狀青霉生長時(shí)期、底物濃度、共溶劑種類、溫度、pH、轉(zhuǎn)速

7、等因素，得出最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件，即在搖瓶培養(yǎng)中，先預(yù)培48小時(shí)，再加入20％的檸檬烯/乙醇溶液（檸檬烯終濃度為840mg/L），于24℃，150 rpm和pH6.0條件下轉(zhuǎn)化12 h。該條件下得到的α-松油醇濃度為833.93±18.67 mg/L，是優(yōu)化之前（202±14.7mg/L）的4.1倍。實(shí)驗(yàn)顯示該生物轉(zhuǎn)化對溫度和pH有較好的耐受性，8-32℃，pH5-8對生物轉(zhuǎn)化的影響均不大。
　　⑶對指狀青霉（Penicillium di

8、gitatum DSM62840）轉(zhuǎn)化檸檬烯為α-松油醇的微生物轉(zhuǎn)化過程中的酶進(jìn)行了初步研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明負(fù)責(zé)該生物轉(zhuǎn)化的酶系具有對映體選擇性，即P.digitatum DSM62840不能將S-(-)-檸檬烯轉(zhuǎn)化為S-（-）-α-松油醇，只能將R-(+)-檸檬烯轉(zhuǎn)化為R-(+)-α-松油醇;該生物轉(zhuǎn)化過程中的酶是可誘導(dǎo)的，當(dāng)在指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）24小時(shí)預(yù)培養(yǎng)物中加入低劑量(84mg

9、/L)的R-(+)-檸檬烯進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，α-松油醇的濃度提高50％;加入氧化酶抑制劑鄰二氮雜菲和8-羥基喹啉后該生物反應(yīng)均被抑制，說明該生物轉(zhuǎn)化酶系可能為細(xì)胞色素P-450單加氧酶。
　　⑷為了初步探討指狀青霉（Penicillium digitatum DSM62840）對檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的機(jī)制，本研究采用iTRAQ技術(shù)對指狀青霉檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化不同時(shí)期(12h和0h)的蛋白表達(dá)做了比較，共鑒定得到20373個(gè)肽段，3644個(gè)蛋白