甾體化合物微生物轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、許多甾體化合物都具有很強(qiáng)的生理活性，臨床上廣泛應(yīng)用于抗炎、抗毒、抗過敏、抗休克等。甾體藥物的發(fā)現(xiàn)及成功合成是近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)醫(yī)藥工業(yè)取得的最引人注目的兩大進(jìn)展之一，甾體藥物也成為僅次于抗生素的第二大類藥物。然而利用化學(xué)法合成時(shí)，往往合成步驟多，得率低，價(jià)格昂貴。1950年Murray和Peterson利用黑根霉高效轉(zhuǎn)化黃體酮為11α-羥基黃體酮，使從孕酮合成皮質(zhì)酮只需要3步，這一研究成果引起了微生物學(xué)者的極大興趣，開展了大量的微生物對(duì)甾體

2、轉(zhuǎn)化的研究工作。 本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 1.甾體化合物轉(zhuǎn)化菌株的篩選 從山東省濟(jì)南市郊區(qū)及黃河附近的稻田、豆地、玉米地以及菜地采集土樣，經(jīng)富集培養(yǎng)，涂布于以植物甾醇和膽固醇為唯一碳源的平板上，分別篩選得到10株和48株菌株，將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC）分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株真菌X4和一株細(xì)菌B4分別能夠?qū)⒅参镧薮己?/p>

3、膽固醇轉(zhuǎn)化成幾種產(chǎn)物。通過形態(tài)觀察和18S rDNA序列分析對(duì)真菌X4進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示X4為串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme Sheld）；利用菌株形態(tài)觀察、BIOLOG技術(shù)和16S rDNA序列分析對(duì)細(xì)菌B4進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示B4為博德特氏菌（Bordetella sp. B4），博德特氏菌轉(zhuǎn)化膽固醇尚屬首次報(bào)道。 2.Fusarium moniliforme Sheld轉(zhuǎn)化玉米粉和黃豆粉中的植物甾醇為A

4、D的研究 Fusarium moniliforme Sheld能夠轉(zhuǎn)化植物甾醇為幾種產(chǎn)物，利用TLC和HPLC對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其中一種產(chǎn)物的Rf（TLC）和Rt（HPLC）與標(biāo)準(zhǔn)品雄甾-4-烯-3，17-二酮（Androst-4-ene-3，17-dione，AD）均一致。通過制備型TLC和HPLC對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，利用紫外光譜（Ultraviolet spectrum，UV），紅外光譜（Infrared spec

5、trum，IR），質(zhì)譜（Mass Spectrum，MS）和核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明該產(chǎn)物為AD。AD是甾體激素類藥物不可替代的中間體，因此具有重要的應(yīng)用價(jià)值。然而，植物甾醇在水中的溶解度非常低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率很低，尋找一種更好的植物甾醇轉(zhuǎn)化體系是非常必要的?？紤]到玉米粉和黃豆粉中含有豐富的植物甾醇，天然狀態(tài)下的植物甾醇在水中的分散度更好，于是對(duì)Fusarium

6、moniliforme Sheld直接轉(zhuǎn)化玉米粉和黃豆粉中的植物甾醇為AD進(jìn)行了研究，結(jié)果表明Fusarium moniliforme Sheld能高效轉(zhuǎn)化玉米粉中的植物甾醇，AD最高產(chǎn)率能夠達(dá)到83.5％，并且省去了植物甾醇的提取過程，節(jié)省了成本；同時(shí)，利用硫磷鐵顯色法對(duì)玉米粉和黃豆粉中的植物甾醇進(jìn)行定量，并與傳統(tǒng)的HPLC定量方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩種方法的定量結(jié)果吻合得比較好，而硫磷鐵顯色法更為快捷方便。 3.Bordet

7、ella sp.B4轉(zhuǎn)化AD的研究 利用篩選得到的Bordetella sp. B4轉(zhuǎn)化AD，對(duì)其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析，結(jié)果顯示Bordetella sp. B4能夠?qū)D轉(zhuǎn)化為三種主要產(chǎn)物，通過IR、MS、UV及NMR等技術(shù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，三種產(chǎn)物分別被鑒定為雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD），9α-羥基-雄甾-4-烯-3，17-二酮（9α-OH-AD），3-hydroxy-9，10-secoandrost-

8、1，3，5-triene-9，17-dione（3-OH-SATD），Bordetella sp. B4轉(zhuǎn)化AD此前未見報(bào)道。 對(duì)β-環(huán)糊精包合AD的條件進(jìn)行了初步摸索，發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精與AD以質(zhì)量比2：1混合研磨，高溫滅菌后，包合效果最好，使AD的溶解度明顯增加，有利于Bordetella sp. B4轉(zhuǎn)化AD的快速進(jìn)行。 利用HPLC法檢測(cè)轉(zhuǎn)化過程中各產(chǎn)物濃度隨時(shí)間變化情況，發(fā)現(xiàn)在30℃和37℃條件下，9α-OH-AD

9、濃度在16 h就能夠達(dá)到最高值，分別為0.502 g/L和0.765 g/L，然而沒有ADD產(chǎn)生；40℃和45℃的條件下都有少量的ADD產(chǎn)生，最高濃度分別能達(dá)到0.123 g/L和0.196 g/L，考慮到9α-羥化酶催化AD生成9α-OH-AD，而1，2位脫氫酶催化AD形成ADD，推測(cè)1，2位脫氫酶的最適作用溫度應(yīng)該高于9α-羥化酶。Bordetella sp. B4對(duì)AD的轉(zhuǎn)化效率優(yōu)于大多數(shù)已報(bào)道菌株，且溫度對(duì)Bordetella

10、sp. B4轉(zhuǎn)化AD的影響也與已報(bào)道菌株不同。 4.Bordetella sp.B4轉(zhuǎn)化膽固醇的研究 利用Bordetella sp. B4轉(zhuǎn)化膽固醇，對(duì)其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析，結(jié)果顯示Bordetella sp. B4能夠?qū)⒛懝檀嫁D(zhuǎn)化成一種產(chǎn)物，通過MS、UV及NMR等方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果證明這個(gè)產(chǎn)物為膽甾酮。通過對(duì)Bordetella sp. B4發(fā)酵液中膽固醇氧化酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Bordetella sp.

11、 B4能夠產(chǎn)胞外膽固醇氧化酶。 利用正交試驗(yàn)對(duì)Bordetella sp. B4產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，酵母粉對(duì)產(chǎn)酶的影響是最大的，隨著濃度的增加，酶活迅速增加，當(dāng)濃度達(dá)到20 g/L時(shí)酶活最高，為最適濃度；膽固醇濃度在3 g/L時(shí)，酶活最高，隨著膽固醇濃度的增加，酶活逐漸下降，其原因可能是膽固醇濃度過高會(huì)造成底物抑制，濃度過低導(dǎo)致誘導(dǎo)作用減弱；葡萄糖濃度為7.5 g/L時(shí)，酶活最高，隨著濃度提高，酶活逐漸降低，其原因可能

12、是葡萄糖濃度過高影響菌體對(duì)膽固醇的利用；微量離子液添加體積為200 mUL時(shí)，酶活最高。經(jīng)過兩輪正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)組合為膽固醇3.0 g/L，葡萄糖7.5 g/L，酵母粉20 g/L，微量離子液200 mL/L。將Bordetella sp. B4接種于最優(yōu)培養(yǎng)基中，膽固醇氧化酶的酶活能夠達(dá)到650 U/L，較優(yōu)化前提高了5倍左右。進(jìn)一步對(duì)其他培養(yǎng)條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化培養(yǎng)基的初始pH為7.0，接種量為4％，轉(zhuǎn)速為260 rpm時(shí)，酶活能夠達(dá)

13、到1700 U/L，較優(yōu)化前提高了13倍。 5.Bordetellasp.B4產(chǎn)膽固醇氧化酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究 利用分級(jí)硫酸銨沉淀、DEAE-cellulose離子交換色譜、Sephadex G100凝膠過濾層析對(duì)Bordetella sp. B4產(chǎn)膽固醇氧化酶進(jìn)行分離純化，獲得電泳純膽固醇氧化酶，SDS-PAGE顯示該酶分子量約為55 kDa；膽固醇氧化酶以膽固醇為底物最適作用溫度為37℃，在50℃以下都比較穩(wěn)定

14、，最適作用pH為7.0，在pH4-10的范圍都比較穩(wěn)定；在pH7.0的磷酸緩沖體系中，以膽固醇為底物測(cè)定時(shí)，該酶的米氏常數(shù)Km為5.56×10-4 mol/L；除了Hg2+和Ag+對(duì)該酶有抑制作用外，大部分金屬離子對(duì)其酶活都有促進(jìn)作用，Cu2+的影響最為明顯，能夠?qū)⒚富钐岣?.19倍；辛醇/水分配系數(shù)（log Pow）較小的甲醇、乙醇和丙酮對(duì)該酶都有抑制作用，而log Pow為-1.38的二甲基亞砜的影響卻很小，該酶在log Pow較大

15、的乙酸乙酯、丁醇、氯仿、苯、二甲苯及環(huán)己胺的作用下都比較穩(wěn)定，顯示了很好的應(yīng)用前景。 6.Bordetella sp.B4產(chǎn)多糖的初步分析 利用分級(jí)硫酸銨沉淀對(duì)膽固醇氧化酶進(jìn)行初步分離時(shí)，有大量的多糖與膽固醇氧化酶共同析出，說明Bordetella sp. B4在產(chǎn)膽固醇氧化酶的同時(shí)還分泌一種多糖。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）能夠與該多糖結(jié)合成絡(luò)合物使其從發(fā)酵液中沉淀出來(lái)，將絡(luò)合物解離、乙醇沉淀、干燥獲得多糖粗品。