l203對(duì)大鼠巨核細(xì)胞培養(yǎng)的影響

1、6 7 O· 論 著 ·重慶 醫(yī)學(xué) 2 0 0 5 年 5月第 3 4卷 第 5 期L 2 0 3 對(duì) 大 鼠 巨核細(xì) 胞 培 養(yǎng) 的影 響 李啟 明， 艾 國平 ， 劉小紅 ， 韓 京 ， 程天 民， 粟永 萍 ( 第三 軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù) 防醫(yī)學(xué)院 全 軍復(fù)合 傷研 究所 ， 創(chuàng)傷 、 燒傷與 復(fù)合 傷 國家重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn) 室， 重慶 4 0 0 0 3 8 )摘 要 ： 目的 了解 TP O 模 擬肽 L2 0 3對(duì)

2、骨 髓抑 制后 大 鼠的促 血 小板 生成作 用及 對(duì) 大 鼠 巨核 細(xì)胞 分 化 、 增 殖的 影響 。方法 應(yīng) 用化 療 藥物卡 鉑 造成 大 鼠骨 髓抑 制模 型 血小板 下 降到接 近零 時(shí) ， 開始 應(yīng) 用 L 2 0 3I L - 3 、 I L 一 1 1 、 生理 鹽 水腹 腔 注射 ， 隔天 1次 ， 共 用 7次。 血 小板 回升后 全部 動(dòng) 物活 殺 ，然后分 離提 取 大 鼠股骨 髓有 核 細(xì)胞 ， 分 別采 用

3、 甲基 纖 維素 法 及 瓊 脂 法進(jìn) 行 巨核 細(xì)胞 培 養(yǎng) 與 誘 導(dǎo)分 化 實(shí)驗(yàn) 。結(jié)果 L 2 0 3 組 巨核 細(xì)胞 集 落數(shù) 明顯 多于其 它組 ， 幾 組在 統(tǒng)計(jì) 學(xué)上 差 別 明顯著 ( P <O ． 0 1 ) 。結(jié)論 L 2 0 3具有 類 似 TP O 的促 進(jìn) 巨核 細(xì)胞 增 殖分 化 、 增加 血 小板 產(chǎn) 生的作 用 。關(guān)鍵 詞 ： 巨核 細(xì) 胞培 養(yǎng) ； L 2 0 3； 卡 鉑 ； 血 小板 中 圖

4、分類 號(hào) ： R 3 6 5文獻(xiàn) 標(biāo)識(shí) 碼 ： A文章 編號(hào) ： 1 6 7 1 — 8 3 4 8 ( 2 0 0 5 ) 0 5 — 0 6 7 0 — 0 4T h ee f f e c to fL2 0 3o nt h er e s u l t so fr a tme g a k a r y o c y t ec u l t i v a t i o nL1Qi — r ui n g， AjGu o — p i n g，Lj U

5、 Xi a o - h o n g， e ta 1 ．( S t a t eKe yL a b o r a t o r yo fT r a u m a，B u r n sa n dC o mb i n e dI n j u r y，I n s t i t u t eo fC o mb i n e dI n j u r y，C o l l e g eo fPr e v e n t i v eMe d i c i n e ， t h eT

6、h i r dMi l i t a r yMe d i c a lU n i v e r s i t y，C h o n g q i n g，4 0 0 0 3 8 ，C h i n a )Ab s t r ac t ： 0b j e a c t i v eT or e s e a r c ho nT P Oa n a l o g u ep e p t i d eL 2 0 3t Ot h et h r o mb o p o i e s

7、 i se f f e c t i v ea n dc u l t u r a lme g a k a r y o c y t ed i f f e r e n t i a t i o n，t h emul t i p l i c a t i o ni n f l u e n c ei nmy e 1 o s u p p r e s s i v er a t s ． M e t h o d sAf t e rc h e mo t h e

8、 r a p e u t i c sc a r b o p l a t i nc r e a t e st h er a tma r r o w s u p p r e s s i o nmo d e l 。 t h r o mb o c y t o p e n i ac o n t i g u i t yc i p h e r ， s t a r t sp e r i t o n e a li n j e c t i o no fL

9、 2 0 3 ，I L 一 3 ， I 卜 11a n dt h ep h y s i o l o g —i c a ls a l i n e，at i m ep e rt WOd a y s ．t o g e t h e rs e v e nt i me si nt WOwe e ks ． Af t e rt h eb l o o dp l a t e l e tc o u n tr e b o u n d。 a l lr a t s

10、we r ek i l l e d ．t h en uc l e a t e dc e l lwe r ei s o l a t e df r o m t h i g hb o nem a r r o w．Th em e t h y l c e l l u l o s ea n dt h ea g a rm e t h o dwe r eu s e dt Oc u l t i v a t ea n dd i f f e r e n —

11、t i a t et h en u c l e a t e dc e l li n t ome g a ka r y o c y t e ． Re s u l t s Th eL2 0 3g r o u pm e g a 1 o k a r y o c y t ec o l o n yn u mb e ro b v i o u s l yh i g h e rt h a no t h e rg r o u p s ． I ns t a

12、t i s t i c st h ed i f f e r e n c ei so b v i o u s( P< O ． 0 1 ) ． Co n c l u s i o nL2 0 3h a st h ef u n c t i o ns i m i l a rt OTPO i np r o mo t i n gt h r o m—b l a s tmu l t i pl i c a t i o nd i f f e r e

13、n t i a t i o na n di n c r e a s i n gb l o o dp l a t e l e tp r o d u c t i o n ．Ke ywo r d s ： m e g a k a r y o c y t ec u l t i v a t i o n；L2 0 3；c a r b o p l a t i n；t h r o m b o c y t e在許 多疾 病 與創(chuàng) 傷 中 ， 嚴(yán) 重 出血

14、、 血小 板 減 少 常 常是 患 者 致 死 的最 直接 原 因 ， 腎 臟疾 病 、 惡 性 腫瘤 的放 射 與 化 學(xué) 治療 后 也常 常 引起 骨髓 抑制 、 全血 細(xì) 胞 減 少[ 1] ， 目前 ， 刺 激 造 血 生長 的紅 系 與粒 系藥 物 已經(jīng)基 本 能夠 滿足 I 臨床 需要 ， 但是 在升 血小 板 方 面 ， 我 國藥 品監(jiān) 督局 唯一 批 準(zhǔn)試 用 的藥 物 只 有 白介 素一 1 1 ，作 為升高 血 小板

15、 的輔 助 藥 物 ， 臨床 應(yīng) 用 效 果不 夠 理 想 ； 血小 板 生成 素是 促 血小 板 生成 的 特 異性 調(diào) 節(jié) 因子 ， 9 O年 代美 國食 品與藥 品管 理 局( F D A ) 曾經(jīng) 批 準(zhǔn)兩 種 重 組 血小 板 生成 素 ( r h T P o和 P Er H u MG D F ) 的試 用 ， 但使 用后 發(fā) 現(xiàn) 雖 然 二 者 體 內(nèi)外 都 具 有促 進(jìn) 巨核細(xì) 胞 增 殖 、 分 化 和 成 熟 及 介

16、導(dǎo) 血 小 板 生 成 的功 效 。但 P E G - r HMMG D F反 復(fù) 施 用 后 ， 其 藥 效 降 低 甚 至 消 失 ，而且產(chǎn) 生 與 內(nèi)源 T P O具 有 交 叉 反 應(yīng) 的 中 和抗 體 ， 中 和 了 內(nèi)源 T P O作 用 ， 加 劇或 引發(fā) 血 小板減 少 癥 發(fā)生 ， 其 臨床 試 驗(yàn) 被迫 終 止 [ 3 “ ] 。因此 ， 從 肽 庫 中篩 選 取 代 細(xì) 胞 因 子 用 于 治 療 的模 擬 肽 ，

17、 已成 為細(xì) 胞 因子 藥物 開發(fā) 的一 條有 效途 徑 。我們 從 肽庫 中篩 選到 T P O模 擬與 人免 疫 球 蛋 白 F c 段 融 合 純 化 出 的融 合 蛋 白命名 為 L 2 0 3 [ 5] ， 本 實(shí)驗(yàn) 擬研 究 了解 該融 合蛋 白對(duì) 大 鼠 巨核 細(xì) 胞分 化 、 成 熟及 血 小板 生成 的促 進(jìn)作 用 。1 材 料 與方 法 1 ． 1 主要 試 劑 和 儀 器 二 氧 化 碳 孵 養(yǎng) 箱 ( 美 國 Q

18、 u e u e產(chǎn) 品F o r ma3 1 1 1 型) ， 超 凈 工 作 臺(tái) ( 蘇 州 凈 化 設(shè) 備 廠 S W— C J 一 2 F D ) ，*基金項(xiàng) 目： 國家 自然科 學(xué)基 金重 點(diǎn)資助 項(xiàng) 目( 3 0 2 3 0 3 6 0 )通 信作 者 倒置 相差 顯 微鏡 、 B X 6 0 顯 微 照 相系 統(tǒng) ( 日本 O l y m p u s 產(chǎn) 品 ) ，高 速冷凍 離 心機(jī) ( B e c k ma n ) ，

19、超 低溫 冰箱 ( s A N Y 0 日本 ) ， 電子 天平 ( D e n v e rAA 一 2 2 0U S A ) 。I MD M 、 1 6 4 0 、 甲基 纖 維 素 和 rME M( G i b c oB R L公 司產(chǎn) 品) ， 小 牛 血 清 、 胎 牛 血 清 ( H y c l o n e ) ，P e r c o l l 密度 梯 度 分 離 液 ( P h a r ma c i a ) ，巰 基 乙醇 (

20、 T B D公 司)和 牛血 清 白蛋 白 ( 美 國 S i g ma 公 司 產(chǎn) 品) ， 碘 化 乙 酰 硫 代 膽 堿 ( 美 國 S i g ma 公 司 ) ； E P O( 羅 可 曼 ) ， T P 0、 G M— C S F ( 日本 麒 麟 ) ， G - C S F ( 惠爾血 ) ， 蘇木 精染 料 。1 ． 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物 及分 組 Wi s t a r 大 鼠 4 O只 ， 雄 性 ， 體 重 ( 1 7 O

21、 ±1 0 ) g ， 購 自重 慶 市 中 醫(yī)研 究所 實(shí)驗(yàn) 動(dòng) 物 中心 ； 實(shí) 驗(yàn)室 飼 養(yǎng) 1 周 后用 于 實(shí)驗(yàn) ； 區(qū) 組 法 隨 機(jī) 分 組 ， 分 為 L 2 0 3組 、 $ 9 5 0組 、 I L 一 1 1組 、 鹽水 對(duì) 照組 、 每 組 8只大 鼠 ； 取骨 髓 時(shí) 每 組 分 成 2 個(gè) 亞組 ，每個(gè) 亞組 4只大 鼠分別 在 培養(yǎng) 時(shí)加 或不 加 L 2 0 3 。1 ． 3 卡鉑致 骨髓 抑

22、制模 型 的制作 與 指標(biāo) 測定 卡 鉑首 次靜 脈 注射 用量 ： 4 0 m g ／ k g ； 每 2 d 進(jìn) 行 1 次尾 靜脈 外 周血 象檢 查 ， 3 周 后 外 周尾 靜脈 血象 血小 板 未下 降到 1 O ×1 O 。 ／ L ， 則 靜 脈 補(bǔ)用 卡 鉑 2 0 m g ／ k g ， 直到外 周 血 象 檢 查 血 小 板 低 于 1 O ×1 O 。 ／ L ， 然 后 各 組 分別 尾靜

23、脈 注 射 L 2 0 3 ( A 組 ) 、 $ 9 5 0 、 I L 廣 1 1 ( B組 ) 、 生 理 鹽 水 ， 1 次／ d ， 連 用 7 d ； 同時(shí) 每 2 天 進(jìn) 行 1次 尾 靜 脈 外 周 血 象 檢 查 ， 3周后 L 2 0 3組 與 I L 一 1 1 組 尾 靜 脈外 周 血 象 血 小 板 均 升 達(dá) 5 O ×1 O／ L以上后 活 殺 ， 取 股 骨骨 髓后 進(jìn) 行 巨核 細(xì)胞 、 紅

24、細(xì)胞 、維普資訊 http://www.cqvip.com 6 7 2均明顯增加； 但 C F U - MK增加更加明顯。圖 5 、 6分別為乙酰 膽 堿脂 酶 染色 情 況 ， 深 棕 色 為 乙 酰 膽 堿 脂 酶 染 色 陽性 。T N C為 總 細(xì)胞 集落 計(jì)數(shù) 。表 2培養(yǎng) 1 4 d后各 組 問細(xì)胞 增 殖情 況 的 比較 ( n 一4 )。P< O． 0 5．’。P< O ． 05。圖 5乙酰膽 堿脂 酶染 色

25、 陽性 集落 圖 6乙酰膽 堿脂 酶染 色 陽性 細(xì)胞 3 討 論 T P O模 擬 肽或 非 肽類 模 擬 物 ， 是 與 T P O 具有 相 似功 能但 不具 同源 結(jié) 構(gòu) 的小分 子物 質(zhì) r 9， 我們 是 從 噬菌 體展 示 肽 庫 的初 級(jí) 和突 變 肽庫 中篩 選獲 得 的 l 4 氨 基 酸殘基 的 T P O模 擬 肽 。該 肽 二聚 體 2 8 肽 的 體 外 活 性 與 T P O 活 性 相 當(dāng) ， 但 該

26、肽 分 子 小 、 體 內(nèi)易被 腎臟濾 過 ， 半 衰期 縮短 。我 們將 T P O模 擬肽與 人 免 疫球 蛋 白 F c 段在 畢 赤酵母 中融合 表 達(dá) ， 借 F c 的鏈 間 二硫鍵 產(chǎn) 生 二價(jià) 的模 擬肽 ， 從 而提 高 了它 的生 物 活性 ， 同時(shí) 也 明 顯延 長 了藥 物在 體 內(nèi) 的半 衰期 。通 過 采 用基 因工 程 方 法 修飾 制 備 的 T P O模 擬 肽二 聚 體 ， 不 僅 均 一性 好 ，

27、而 且代 價(jià) 低 ， 操 作 比較 簡 便 ； 相關(guān) 文 獻(xiàn)研 究 報(bào) 告 證實(shí) ． T P O模 擬 肽 活 性 高 、 開 發(fā) 代 價(jià) 小 、 不 具有 免疫 原性 ， 也 不會(huì) 刺激 機(jī) 體產(chǎn) 生相 應(yīng)抗 體 。 這 為其 取 代 T P O應(yīng)用 于 血小 板 減少 癥 治 療 提 供 了 可能 ． 對(duì) 于 該模 擬 肽 融 合 蛋 白的免 疫原 性 問題 我 科 另 一 位 碩 士研 究 生 已進(jìn) 行該 工 作 ， 并 將專 門

28、報(bào) 道 。重慶 醫(yī)學(xué) 2 0 0 5 年 5月第 3 4 卷 第 5 期文 獻(xiàn)報(bào) 道 巨核 細(xì)胞 培 養(yǎng) 方 法 主要 有 ： 血 液凝 塊 法 、 瓊 脂 法 及 甲基 纖維 素法 ；血液 凝 塊法 ”主要適 用 于臨 床人 的標(biāo) 本 進(jìn) 行 巨核 細(xì) 胞培 養(yǎng) ， 并 且需 要 病 人 血清 作 為 巨核 細(xì) 胞培 養(yǎng) 、 分 化 的誘 導(dǎo) 因素 ； 在 我們 的 大 鼠實(shí)驗(yàn) 中不 適合 。我 們從 進(jìn)行 的巨核 細(xì) 胞培 養(yǎng) 的

29、 實(shí)驗(yàn) 中體會(huì) 到 ， 甲基 纖維 素 法 比較 好 使 用 ， 條 件 易 于控 制 ； 實(shí) 驗(yàn)過 程便 于 操作 ， 以后 染色 容易 進(jìn)行 ； 而瓊 脂法 的 瓊 脂則 太 易凝結(jié) ， 當(dāng)再 溶 解時(shí) ， 容 易 造成 培 養(yǎng)初始 細(xì)胞 的死亡 ，如 果 初始 培 養(yǎng) 細(xì)胞 添 加 稍 晚 ， 則 將 發(fā)生 凝 結(jié) ； 期 間間 隔 時(shí) 間太 短 ， 常造 成無 添加 入培 養(yǎng) 基 中必要 的細(xì)胞 因子 ； 因此 ． 在 我們 的

30、 研 究 中 ， 采用 瓊脂 法 失敗 的原 因可 能是 在 瓊脂 加入 培養(yǎng) 基時(shí) 再 溶 解 的 溫度 過 高 ， 造 成 了骨髓 有 核 細(xì)胞 的死 亡 ， 以至 以 后瓊 脂 法 中培養(yǎng) 的細(xì) 胞均 死 亡 。大 鼠股 骨 骨髓 中分 離 出單 個(gè)核 細(xì)胞后 ． 我 們?cè)?培養(yǎng) 體 系 中的一組 加 用 L 2 0 3 ， 細(xì)胞 培養(yǎng) 分化 l O ～ 1 4 d的觀測 計(jì) 數(shù) ， 結(jié)果 表 明培 養(yǎng)體 系 中加 用 L 2 O

31、 3組 誘 導(dǎo) 分 化 生 成 的 巨 核 細(xì) 胞 集 落 數(shù) 量 明顯 多 于未 加 L 2 0 3 組 ； 從 增 加 C F U - MK 的作 用 明顯 強(qiáng)于增 加 B F U — MK 的作 用看 ， 雖然 可 以基 本確 認(rèn) L 2 0 3 具 有促進(jìn) 體外 培養(yǎng) 的巨 核 細(xì)胞 的 增 殖 、 分 化作 用 ， 但 是 可能 效 應(yīng) 是 以促 進(jìn)分 化 為主 ， 并 且需 要其 它 因 子如 E P O、 G M— C S

32、 F及 B 一 巰 基 乙 醇 等 的配 合 。結(jié)合 我們 在 動(dòng)物 體 內(nèi) 注射 L 2 0 3后 ， 尾 靜 脈 外 周 血檢 測 中血 小板 的 回 升 明 顯 高 于 對(duì) 照 組 ， 并 且 治療 組 均 無 大 鼠 死 亡 ， 對(duì) 照 $ 9 5 0 、 生 理 鹽 水 組 大 鼠均 出 現(xiàn) 明 顯 出 血 ； 全 部 死 亡 。因 此 ， 可 以確定 我 們研 制 的 L 2 0 3 具 有 促 進(jìn) 大 鼠血 小 板 生 成

33、作 用 。參 考文 獻(xiàn) ：V a n — G e e tC ．T h r o mb o p o i e s i s ： n e wc o n c e p t s [ J ] ． V e r hKAc a dGe n e e s k dBe l g， 2 0 0 4， 6 6 ( 1 ) ：5I t a l i a n o ， J o s e p hE J ， L e c i n eP， e ta 1 ． B l o o dp l a t

34、 e l e t sa r ea s -s e mb l e dp r i n c i p a l l ya tt hee n d so fp r o p l a t e l e tp r o c e s s e sp r o d u c e db yd i f f e r e n t i a t e dm e g a k a r y o c y t e s [ J ] ． JC e l lB i -o l ， 1 9 9 9， l 4

35、 7 ( 6 )： 1 2 9 9Ya n gC， Xi aY， L iJ ， e ta 1 ． T h ea p p e a r a n c eo fa n t b t h r o m—b o p o i e t i na nt i b o d ya n dc i r c u l a t i n gt h r o m b o p o i e t i n - I g G c o m p l e x e si nap a t i e n

36、td e v e l o p i n gt h r o m b o c y t o p e n i aa f t e rt h ei n j e c t i o no fP E G - r Hu MG D F E J ] ． B l o o d ， 1 9 9 9 ． 9 4 ： 6 8 1An d r e wsRG ， W i n k l e rA ， M v e r nD， e ta 1 ．Re c o m b i n a n th

37、 u ma nl i g a n df o rM P L ， m e g a k a r y o c y t eg r o wt ha n dd e v e l —o p me n tf a e t o r ( M GDF)。 s t i m u l a t e st h r o m b o p o i s i si nv i v oi nn o r m a la n dmy e l o s u p p r e s s e db a u

38、 o o n s l , J ] ． S t e mC e l l s ，1 9 9 6， 1 4： 6 61劉 曉宏 ， 粟 永 萍 ， 王 軍平 ， 等． 重 組 人 白細(xì) 胞介 素 3對(duì)環(huán) 磷 酰胺 所致 犬造 血 損傷 的治 療作 用 I - J ] ．中 國實(shí) 驗(yàn)血 液學(xué) 雜 志 ． 1 9 9 8 ． 6 ( 4 ) ： 3 0 4Z we e g ma nS ， Va nD B J ， Mu sAM ， e ta 1 ．B

39、 o n ema r r o ws t r o m a lp r o t e o g l y c a n sr e g u l a t eme g a k a r y o c y t i cd i f f e r e n t i -a t i o no fh u ma np r o g e n i t o rc e l l sl , J ] ． E x pC e l lR e s ． 2 0 0 4 ，2 9 9 ( 2 )：3 8 3

40、Ru b i nCI ，F(xiàn)r e n c hDL。 At we hGF． S t a t hmi ne x p r e s s i o na n dme g a k a r y o c y t ed i f f e r e n t i a t i o n： ap o t e n t i a lr o l ei np o l y p l o i d y [ ] ]E x pH e ma t o [ ， 2 0 0 3 ， 3 l ( 5

41、) ： 3 8 9F u ji mo t oTT， Ko h a t aS ， S u z u k iH， e ta 1 ． P r o d u c t i o no ff u n c t i o n a lp l a t e l e t sb yd i f f e r e n t i a t e de m b r y o n i cs t e m ( E S )c e l l si nv i t r o l , J ] ． B l o